PCR (polymerase chain reaction) polimeraz zincir reaksiyonu olarak da adlandırılan reaksiyon için kullanılan cihaza termal döngü cihazı denir. Thermal cycler ya da termal döngü cihazı çalışma prensibi oldukça basittir. Termal döngü cihazı sadece tanımlanan zaman aralığında sıcaklığı değiştirir. Peki bu kadar basit bir işlem nasıl olurda DNA kopyasını oluşturur. PCR cihazını incelemeden önce hücre içinde DNA replikasyonun nasıl olduğunu tekrar hatırlamamız gerekiyor.
Klasik PCR cihazı ya da termal döngü cihazı sadece sıcaklığı değiştiriyor demiştik. Peki ne kadar süre ve kaç derece bu protokol neye göre belirlenir.
Termal döngü cihazı önce 95 C de yaklaşık 5 dakika bekler. Bu bekleme aşamasında cihazın içine konulan PCR tüplerinin içinde bulunan DNA çift zinciri arasındaki hidrojen bağları kopar ve yüksek sıcaklıktan dolayı DNA fragmanları bir araya gelemez.
Daha sonra sıcaklık yaklaşık olarak 50-60 C arasında yaklaşık 1 dakika bekler. Bu bekleme aşamasında PCR tüpünün içinde bulunan ileri veya forward geri veya reverse primerler gidip DNA tekli fragmanındaki karşılığına bağlanır.
Sıcaklık daha sonra 68-72 C arasına getirilip çoğaltılacak olan gen bölgesinin uzunluğuna göre belirlenen bir sürede bekletilir.
Bu işlem bir döngü olarak adlandırılır. Bu işlem ortalama 20 döngü yapılabilir. Daha uzun döngüler DNA polimeraz enziminin hatalı işlem yapmasına neden olabilir.
Daha sonra döngüler bittikten sonra yeni oluşan DNA zincirinin eksik kalan bölgeleri olabilir düşüncesiyle son defa ortalama 68-72 C de yaklaşık 5 dakika bekletilir.
Yeni DNA fragmanları degrede olmaması için işlem bittikten sonra sıcaklık 4 C ye ayarlanır.
Sıcaklık ve sürelerin yaklaşık olarak ifade edilmesinin nedenleri
DNA polimeraz enziminin optimum çalışma sıcaklığı
Primerlerin uzunluğu
Oluşturulacak olan DNA fragmanlarının uzunluğu
PCR cihazının üzerinde bir kapak bulunur ve bu kapakta ısıtma bloğu vardır. Bu kapağın sıcaklığı PCR tüplerine verilen sıcaklıktan daha yüksek olmalıdır. Aksi halde PCR tüpü içindeki sıvı tüpün kapağına buharlaşıp birikir. Böylelikle PCR tüpünün içinde altta kalan kısımda konsantrasyon artar ve PCR işlemi sonucunda Ürünleri görmek için yürüttüğünüz agaroz jelde hayal kırıklığından başka bir şey gözükmez.
Örnek PCR protokolü:
| Cins |
StokKonsantrasyon |
AlınanMiktar |
SonKonsantrasyon |
| Kalıp DNA’sı |
40 ng/ µl |
5 µl |
250 ng |
| İleri Primer |
10 µM |
5 µl |
1 µM |
| Geri Primer |
10 µM |
5 µl |
1 µM |
| dNTP Karışımı |
10 mM |
5 µl |
1 µM |
| Reaksiyon Tamponu |
10 X |
5 µl |
1 X |
| DNA Polimeraz |
5 U |
1 µl |
0,1 U |
| Deiyonize Su |
– |
24 µl |
– |
| Toplam |
– |
50 µl |
– |
| Program |
Sıcaklık |
Süre |
Döngü Sayısı |
| İlk Denatürasyon |
95 oC |
5 dakika |
1 |
| DenatürasyonBağlanma
Polimerizasyon |
95 oC |
30 saniye |
30 |
| 55 oC |
30 saniye |
| 72 oC |
1.5 dakika |
| Son Polimerizasyon |
72 oC |
5 dakika |
1 |
|
|
|
|
