Aylık Arşiv: Mayıs 2015

Akım Hücre Ölçer Nozzle Bakımı İncele

  • Her nozzle için CST yapılmalı
  • Her çalışmadan sonra nozzle temizliği yapılmalı
  • Nozzle temizliği için ultrasonik banyo kullanılmalı
  • Nozzle üzerinde bulunan contaya dikkat edilmelidir
  • Nozzle peçete vb. ile silinmemelidir
  • Temizleme işleminden sonra üzerindeki su kendiliğinden uzaklaşması beklenmeli
  • Nozzle deliğine iğne ucu sokulmamalı

Gen Klonlama İnceleme

Moleküler biyologlar, canlı hücredeki moleküllerin, hücre yapısı ve fonksiyonuna nasıl katıldıklarını anlamak isterler. Proteinler hücrenin yapı taşlarını oluştururlar ve bunlar da genlerin  ürünüdürler. Moleküler biyologlar dikkatlerini, proteinlerin yapı ve fonksiyonlarını veya onları kodlayan genlere odakladılar.

Ökaryotik türlerde, bir hücre binlerce farklı protein oluşturur. Bunların hepsinin üstesinden gelmek oldukça zordur. Bu yüzden genleri tek tek ele alarak çalışmak daha kolaydır. Bunun içinde en iyi yöntem o proteini kodlayan genin klonlanmasıdır.

Gen klonlama: Bir genin birçok kopyasını oluşturma ve izolasyonunu ifade eder. Bir genin klonlanması için gerekli laboratuar yöntemleri 1970 lerde bulunmuştur. Bu tekniklerin geliştirilmesiyle bulunan yöntemler hücre biyologları, biyokimyacılar, bitki biyologları, mikrobiyologlar ve biyoteknologlar tarafından kullanılmıştır.

Klonlama çalışmaları 2 DNA molekülünü kapsar.

1- Kromozomal DNA

2- Vektör DNA

Gen klonlanmasında genin kaynağı geni taşıyan türün kromozomal DNA sıdır.  Kromozomal DNA yı hazırlamak için ilk olarak organizmadan hücresel doku elde edilir. Kromozomal DNA nın hazırlanması için hücrenin parçalanması, DNA nın çıkartılması ve saflaştırması için biyokimyasal yöntemler uygulanır.

  1. tip DNA ise vektör DNA olarak bilinen özel DNA parçasıdır. Vektör DNA nın amacı klonlanacak olan DNA parçasının taşınmasında görev yapmaktır. Vektörün en büyük özelliği içinde bulunduğu hücrede (konak hücre) çoğalabilmesidir. Böylece taşıdığı gen de onunla birlikte çoğalacaktır.

 

VEKTÖR DNA

Gen klonlamasında kullanılan aracı moleküllere vektör denir.  Vektörler konakçı organizmada, konakçı organizmadan bağımsız olarak replikasyon (çoğalma) gösterirler. Bakteri DNA’sı harici kendi kendien replike olabilen minikromozomlardır.

BAŞLICA VEKTÖRLER

  • Plazmidler
  • Bakteriyofajlar
  • Kosmidler
  • Bakteri yapay kromozomları (BAC)
  • P1 kökenli yapay kromozomlar (PAC)
  • Maya yapay kromozomları (YAC)
  • Memeli yapay kromozomları (MAC)
  • İnsan yapay kromozomları (HAC)

Doğal olarak bulunan plazmitler büyük ve kullanışsız olduklarından, bunların yerine in vitro ortamda amacına yönlik olarak hazırlanan yapay plazmid vektörler kullanılmaktadır. Üzerlerinde ampisilin, tetrasiklin, kanamisin gibi antibiyotiklere karşı direnç genleri taşırlar. Bunlar seleksiyonda önemli fonksiyonu olan marker genlerdir. Plazmid vektör 10 kb yabancı DNA alabilir.

Bakteriyofajlar

Faj’lar bakteriyi enfekte eden virüslerdir. Fajların bazıları, kendi konakçılarında lizis meydana getirmelerine karşın, bir kısmı da bakteri içinde bulunduğu halde herhangi bir zararlı etkide bulunmazlar.

Bu tür fajlar bakterinin genomu ile birleşir, onun bir devamı haline gelir, onunla birlikte eş zamanlı olarak replike olur ve her hücre bölünmesi sırasında da, bakteri DNA’sı ile birlikte kardeş hücreye aktarılır.

Kosmidler

Kosmid vektörler, bir bakteriye ait ve replikasyon orijin bölgesine sahip plasmidle, buna birleştirilmiş lambda fajı yapışkan ucundan (cos, cohesive ends) oluşturulmuşlardır (hibrit vektörler).

Tek cos bölgeli kosmid vektörler: Bu vektörler için lambda fajının  lineer faj DNA’sındaki cos bölgeleri RE’lerle kesilerek çıkarılır. Bunlar, pBR322 plasmidinin tetrasiklin geni içine integre edilir ve böylece tek bir cos bölgesine sahip kosmid vektör elde edilir.

Böyle bir kosmid yaklaşık 6 kb uzunlukta olup, yapısında plasmide ait replikasyon orijini (RO) ,ampr geni ve lambda fajının cos bölgesi bulunur. Bu tarzda hazırlanan kosmid yaklaşık 35-40 kb uzunlukta yabancı bir geni kabul edebilir ve aktarabilir.

Çift cos bölgeli kosmid vektörler:  İki cos bölgesine ve iki markere (ampr, kanr) sahip vektörlerdir. Kosmidler iki RE ile aynı anda kesildiğinde iki lineer parça elde edilir ve her birinde bir cos bölgesi ve bir marker bulunur. Yabancı gen DNA’sı, iki cos bölgesi arasına integre edilir. diğer işlemler aynen tek cos bölgeli kosmidde olduğu gibi yürütülür.

Mekik (shuttle) kosmid vektörler:

Bu  tarzda dizaynı yapılan vektörlerde cos bölgeleri ve markerleri yanı sıra prokaryotik ve ökaryotik hücrelere ait genetik DNA sekansları da bulunur. Bunlar da 35-40 kb’lık yabancı DNA’yı  kabul edebilir ve transferini sağlayabilir.

 Bakteri yapay kromozomu (BAC)

Farklı türlerden alınan  100,000 ile 200,000 baz büyüklüğünde DNA parçalarının bakteride klonlanması ile olur. Klonlandığı zaman hücre içinde birçok kopyası olur. BAC vektörleri doğal olarak var olan büyük bakteri plazmidi F-faktör üzerine kurulurlar. BAC vektörleri büyük DNA fragmentlerini klonlamada ve özellikle büyük genomların sıra dizilerinin eldesinde kullanılırlar.BAC vektörü 300kb’a kadar yabancı DNA’yı içine alabilir.

Maya yapay kromozomu (YAC)

Çok büyük DNA (200-500 kb veya 1–2  Mb ) fragmentlerini kabul edebilir. Bir kromozomun önemli öğeleri olan telomerleri, sentromeri ve replikasyon başlangıç noktasını içerirler. Oldukça kararlıdır ve insan genomunun haritalanmasında, genomik kütüphanelerin yapılmasında etkili bir şekilde kullanılır.

 Memeli yapay kromozomu (MAC)

Memeli yapay kromozomları, kromozomların fonksiyonel bölgelerini (sentromer,telomer,replikasyon orijini) taşıyan ve hücreden bağımsız olarak çoğalabilen moleküllerdir.MAC yüzlerce kb büyüklüğünde genomik DNA taşıyabilir.

MAC oluşumu en yakın örnek olan YAC’a göre çok daha zordur.Çünkü memeli telomeri maya telomerinden 10-100 kat; memeli sentromeri ise maya sentromerinden yaklaşık 1000 kat daha büyüktür.Memeli sentromer ve telomer dizilerinin çok fazla sayıda tekrarlanması da memeli yapay kromozomu oluşturulmasını zorlaştırır. Bunlar hem E. Coli, hem de ökaryot alıcıda çoğalan shuttle vektörlerdir. Virüsten gelen ökaryotik replikasyon orjini taşırlar (SV40).

Klonlanan genin promoter dizisi ve transkripsiyon terminasyon sinyali ökaryotik olmalıdır.

İnsan yapay kromozomu (HAC)

HAC’lar, insan DNA dizileri, sentromer dizisi, telomer dizisi ve DNA replikasyon noktasının olması ile gen tedavisi için avantajları olan bir vektördür. Daha büyük insan DNA’sini taşıması; stabiliteyi sağlayacak sentromer dizisinin olmasi; kromozom yapısının stabilitesini ve degradasyonunu önleyen telomer dizilerinin olmasi; DNA replikasyon noktası ile bir hücre siklusundan diğerine normal S fazında replikasyonu düzenleyebilmesi avantajlarıdır. 6-10 megabaz uzunluğundadır. Transferi, liposomlar veya reseptörler aracılığı ile veya in vivo olarak da oluşturulabilir.

DNA vektöre nasıl sokulur?

Burada önemli bir olayda DNA nın vektör içerisine sokulabilmesidir. Bunun için DNA nın kesilmesi gerekir. Restriksiyon enzimlerin bulunması bu sorunu çözmüştür. Bu enzimler DNA da özel baz dizilerine bağlanır ve DNA nın her iki ipliğini de keserler. Bu enzimler birçok farklı bakteri tarafından doğal olarak yapılmaktadır. Bu enzimlerin amacı bakteriyi yabancı DNA saldırılarından korumaktır. Bakterilerde yapılan çalışmalar sonunda yüzlerce restriksiyon enzim bulunmuştur ve bugün bunlar ticari olarak satılmaktadır. DNA manüplasyonunda kullanılan enzimler

1-DNA Polimerazlar:

Nükleotidlerin polimerizasyonunu katalizleyen enzimdir.Bu enzim DNA nın tek ipliğini kullanarak deoksiribonukleotidleri 3’ ucuna kademeli olarak ilave eder ve ipliğin uzamasını sağlar. Burada DNA polimeraz DNA ipliğini kalıp olarak almıştır. RNA ipliğini kalıp olarak kullanan DNA polimeraz ise Ters transkriptaz olarak tanımlanır. Bu bir RNA ipliğinden bir DNA ipliğinin yapımını sağlar.3 tip DNA polimeraz bulunur.

 1-Pol.I, DNA daki zararların onarımında, RNA primerin uzaklaştırılmasında ve meydana gelen boşlukların doldurulmasında iş görür.

 2-Pol II, bununda DNA nın onarımında görev yaptığı kabul edilmektedir

 3- Pol III, replikasyondan sorumlu esas enzimdir.

DNA polimerazlar bir ipliğin sentezini başlatamazlar. Bunların sentez yapabilmeleri için serbest bir 3’ uca gereksinim duyarlar. Bu durumda serbest 3’ uc RNA polimeraz enzimi ile yapılan yaklaşık 10 nukleotidlik bir dizi ile sağlanır bu diziye primer denir.

2-RNA polimeraz:

 Bu enzim bir DNA ipliğini kalıp olarak kullanıp bir RNA ipliği meydana getirir. RNA polimeraz temelde DNA polimerazla aynı temel özelliklere sahiptir.

3-DNA ligaz:

Bu enzimler 5’-PO4 ve 3’-OH grupları arasında fosfodiester bağı oluşturur. Nukleotidleri birbirine bağlarlar.

4-Nükleazlar

Bunlar fosfodiester bağlarını yok eden fosfodiesteraz cinsi enzimlerdir. İşlevleri bakımından iki gruba ayrılırlar.

1-  Eksonükleazlar { Hidroliz reaksiyonu  için serbest bir uca gereksinim duyarlar}.

2-  Endonukleazlar { Böyle bir gereksinim duymazlar}

Eksonükleazlar etkilerini göstermek için bir zincir ucuna gerek duyarlar. Tek yada çift zincirli halkasal DNA larda etkili değildirler.

Bunlar kesme yönlerine göre 2 tip mevcuttur.

5’→3’  olanlar

3’→5’  olanlar

Endonukleazlar

Çift zincirli DNA da özel dizileri tanıyan ve her iki ipliğinde kesme yapan enzimlerdir. Bu enzimlerin görevi:   yabancı DNA ları kesip atmaktır  Restriksiyon enzimleri 3 grup altında toplanır

Tip II Restriksiyon endonukleazlar İki tip kesme şekli gösterir

  1. Kör uc oluşturarak kesme
  2. Yapışkan uc oluşturarak kesme

Ribonukleazlar

Bu enzimler RNA ların işlenmesinde önemli görevler yaparlar.

1-  Primer transkiptin olgun RNAya  geçmesinde RNA ya ilaveler yapmak veya çıkarmak

2-  İntronların kesilip çıkarılmasını sağlamak

3-  Fosfataz bağlarının hidrolizini sağlamak.

Bunlar da 2 tipe ayrılırlar

Endoribonukleazlar ( Zincir içindeki bağları keserler)

5’→3’  ve 3’→5’ yöne kesme yapanları mevcuttur Ekzoribonükleazlar RNA nın ucundan nukleotidleri ayırırlar Artık bir genin klonlanması için elimizde her türlü aletimiz mevcuttur. Farz edelim ki elimizde ampR ve lac Z genini taşıyan bir plasmid vektörümüz ve kromozomal DNA mız var. Her ikisi de aynı restriksiyon enzimi ile kesilir, böylelikle plasmid de ve kromozomal DNA da meydana gelen kesik uçlar aynı yapışkan uçları içerecektir. Kromozomal DNA kesilmesi sonucu çok sayıda fragment meydana gelir. Biz içinde  β-globin genini içeren DNA parçasını plasmide sokmak istiyoruz, bunu plasmide girip girmediğini bu genin çalışmasıyla anlayabiliriz. Bu çalışma esnasında bu geni içermeyen birçok fragment plasmide girecektir ancak seçici besi yeri  ile bu genin girip girmediği anlaşılabilir.

Burada farklı bağlanmalar oluşabilir.

  1. Vektör tekrar kendine bağlanabilir
  2. Vektöre kromozomal DNA bağlanabilir. Bu β-globin geni içerebilir veya içermez Vektörün E. coli (konak) hücresine transferi için, bakteri hücresi ile uyumlu olmalıdır. Eğer uyumlu ise buna kompotent hücre denir. Vektör bakteriye transfer olabilir. Şayet değilse bazı deterjantlarla hücre kompotent hale getirilmelidir. Bu olaya transformasyon denir. Bakterinin plasmidi alıp almadığı işret genleri ile anlaşılabilir. Burada plasmid konağa girmişse bu bakteri amp içeren besi yerinde yaşayabilir. Çünkü plasmidle birlikte amp direnç geni de bakteriye aktarılmış olmaktadır. Plazmidi alan hücrelerde iki tiptir
  3. Kromozomal DNA yı içerenler
  4. Kromozomal DNA yı içermeyenler.

Bunun içinde plasmidin yapısında bulunan Lac Z geni  sayesinde anlayabiliriz. Kromozomal DNA bu genin içerisine sokulmaktadır. Bu gen  β-galaktozid enzimini kodlamaktadır. Kromozomal DNA bu gen içerisine sokulduğunda artık bu enzim üretilemez. ve bu durumda  olan bakteri hücreleri beyaz koloni oluştururlar. Kromozomal DNA içermeyenlerde genin yapısı bozulmadığı için koloniler mavi renkli olurlar. Beyaz koloniler insan kromozomal DNA sını içeren kolonilerdir. Bundan sonraki aşama ise β-globin genini içeren koloninin bulunmasıdır.

Klonlama Nasıl Yapılır

                                                                     PCR Örnek Protokol

 

 Cins StokKonsantrasyon AlınanMiktar SonKonsantrasyon
 Kalıp DNA’sı  40 ng/ µl  5 µl  250 ng
İleri Primer 10 µM 5 µl 1 µM
Geri Primer 10 µM 5 µl 1 µM
dNTP Karışımı 10 mM 5 µl 1 µM
Reaksiyon Tamponu 10 X 5 µl 1 X
DNA Polimeraz 5 U 1 µl 0,1 U
Deiyonize Su – 24 µl –
Toplam – 50 µl –
Program Sıcaklık Süre Döngü Sayısı
İlk Denatürasyon 95 oC 5 dakika 1
DenatürasyonBağlanmaPolimerizasyon 95 oC 30 saniye 30
55 oC 30 saniye
72 oC 1.5 dakika
Son Polimerizasyon 72 oC 5 dakika 1

PCR ürünün modifikasyonu için restriksiyon enzim kesimi

Cins StokKonsantrasyon AlınanMiktar SonKonsantrasyon
 PCR ürünü 70 ng/ µl 45 µl 2250 ng
Enzim A 10 U 1  µl 0,1 U
Enzim B 10 U 1  µl 0,1 U
Reaksiyon Tamponu 10 X 10  µl 1 X
Deiyonize Su – 43 µl –
Toplam – 100  µl –

Vektör olarak kullanılacak olan plasmidin restriksiyon enzim kesimi

Cins StokKonsantrasyon AlınanMiktar SonKonsantrasyon
 plazmid DNA 70 ng/ µl 55 µl 3850 ng
Enzim A 10 U 2  µl 0,1 U
Enzim B 10 U 2  µl 0,1 U
Reaksiyon Tamponu 10 X 10  µl 1 X
Deiyonize Su – 31 µl –
Toplam – 100  µl –

 Insört ve Vektör Ligasyon Reaksiyonu

Cins StokKonsantrasyon AlınanMiktar SonKonsantrasyon
 Insört / Enzim A-B 70 ng/ µl 1 µl 70 ng
Vektör / Enzim A-B 30 ng/ µl 3 µl  90 ng
T4 DNA Ligaz    5 U/μl 1 µl 0,2 U
T4 DNA Ligaz Tamponu 10 X 1  µl 1 X
Deiyonize Su – 4 µl –
Toplam – 10 µl –

 Transformasyonun Koloni PCR ile kontrolü

 Cins Stok Konsantrasyon Alınan Miktar Son Konsantrasyon
 Kalıp DNA (koloni olarak )İleri Primer  –10 µM  –1 µl  –0,4 µM
Geri Primer 10 µM 1 µl 0,4 µM
dNTP Karışımı 10 mM 1 µl 0,4 µM
Reaksiyon Tamponu 10 X 2,5 µl 1 X
Paq DNA Polimeraz 5 U 0,5 µl 2,5 U
Deiyonize Su – 19 µl –
Toplam – 25 µl –

 

Kandan Total RNA İzolasyonu

Kandan Total RNA İzolasyonu

kan mor kapaklı tüplere (hemogram tüpleri) alınmalı

alınan kan aynı gün içinde RNA izolasyonu yapılmalıdır. kan alındıktan sonra +4C de bekletilmelidir.

hemogram sonuçları olmalı

WBC sayısı en fazla 70 milyon olmalıdır.

lökosit sayısı oranlaması yapılmalıdır. bu oran için;

1 ul de 8 000 hücre varsa

x ul de 70 milyon hücre vardır

x= a ml

a ml kan alınıp üzerine 3a ml RBC lysis solution eklenir.

WBC sayısına bağlı olarak kullanılack olan solusyonlar kit protokolünde bulunuyor.

 

* alınan kanın 3 hacmi kadar RBC lysis solüsyonu eklenir. karıştır.

* oda sıcaklığında 10 dakika inkübasyon (arada karıştır)

* santrifüj 2 000xg  2,5 dakika (santrifüj sonrasında altta beyaz hücreler lökositler olmalı)

* RBC lysis solüsyonu ekle (kullanılan kanın 2 katı kadar- bu aşama RBC lerden tam olarak uzaklaşmak için gerekli)

* santrifüj 2 000xg 2,5 dakika at RT

* süpernatanı dök falkonu peçete üstüne ters çevir.

* falkonda kalan süpernatanı tüpün dibine değdirmeden pipetle al.

* kitin içinde lysis solusyonu var.  B-merkaptoethanol eklenmeli (1 ml lysis- 10 ul B-merkaptoethanol: hazırlanan solüsyon 1 ay boyunca oda sıcaklığında saklanabilir )

* lysis(B-merk içermeli) solüsyonunu ne kadar ekleneceği kit protokolünde sayfa 14 de yazıyor.

* lysis eklendikten sonra pipetaj yap. (Bu kısım önemli, vortex yap ve sümüksü fazın akışkan halde olduğunu gör, eğer vortex aşamasından sonra  akışkan bir şekilde pipete gelmezse üzerine lysis tamponu ekle)

* bu aşamada -20C de bekletilebilir (4 hafta)

* önce yeşil kolon kullanılır ve altta kalan sıvı alınır (kolon elek olarak kullanılır atıklar istenmeyenler üstte kalır)

* santrifüj 400 xg de 1,5 dakika at RT

* santrifüj bittikten sonra kolon 180 derece çevir tekrar santrifüj 400 xg de 1,5 dakika at RT

* altta kalan lyzatı byeyaz kolonun içine aktar.

* bu aşamada kolonun filtreli bölümüne isimler yazılmalı kolonun kapağına yazılması anlamlı olmaz

* santrifüj max xg de 1,5 dakika at RT

* santrifüj bittikten sonra kolon 180 derece çevir tekrar santr.

* 400 ul wash 1 ekle

* santrifüj 13 000 xg de 2,5 dakika at RT

* alt kısmı at kolonu temiz tüpe aktar

* 200 ul wash 2 ekle

* santrifüj 13 000 xg de 1,5 dakika at RT

TEKRAR

* 200 ul wash 2 ekle

* santrifüj 13 000 xg de 1,5 dakika at RT

 

ELUTION

* kolonu yeni tüpe aktar

* 50 ul elution buffer ekle

* * 200 ul wash 2 ekle

* santrifüj 13 000 xg de 1,5 dakika at RT

 

ALTTA KALAN KISIM TOTAL RNA -70 -80C ARASINDA SAKLANIR

İzole edilen total RNA – 80C de küçük hacimlerde saklanmalıdır.

 

Doku veya Hücre Ekstraktı Hazırlanması

      Doku veya Hücre Ekstraktı Hazırlanması:

Doku ekstraktı hazırlanması: Alınan dokulara örnek tamponu eklenerek (50 mM Tris-HCl, pH 7.9, 1 mM PMSF, 1 mM DTT, 5 μg/mL Aprotinin, 5 μg/mL Leupeptin, 5 μg/mL Pepstatin A) doku ekstraktları hazırlanır.

Hücre ekstraktı hazırlanması: Hücre kültürü gruplarından alınan örneklerin besi ortamı spire edildikten sonra, soğutulmuş PBS ile yıkanır. Üzerine örnek tamponu eklenerek (50 mM Tris-HCl, pH 7.9, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1 mM PMSF, 1 mM DTT, 5 μg/mL Aprotinin, 5 μg/mL Leupeptin, 5 μg/mL Pepstatin A) hücre ekstraktları hazırlanır.

Protein Ölçümü

SDS-PAGE Jellerinin Hazırlanması

Seçilen konsantrasyondaki ayırıcı jel için monomer karışımı, aşağıdaki tablo izlenerek

hazırlanır.

Ayırıcı (separating) Jel Hazırlanması: 0.375 M Tris, pH 8.8

%5 %7 %10 %12 %15

Saf su 7.5 12,7 mL 10.7 4.65 mL 3.65 mL

3 M Tris-HCl, pH 8.8 1,25 mL 2,5 mL 2,5 mL 1.25 mL 1.25 mL

%20 (w/v) SDS 0.05 mL 0,1 mL 0,1 mL 0.05 mL 0.05 mL

Akrilamid/Bis-akrilamid

(%29.2/%0.8 w/v)

1.15 mL 4,6 mL 6,6 mL 4.0 mL 5.0 mL

%10 (w/v) amonyum persülfat 0.05 mL 0,2 mL 0,2 mL 0.05 mL 0.05 mL

TEMED 0.005 mL 0.02 mL 0,02 mL 0.005 mL 0.005 mL

Total monomer karışımı 10.005 mL 20,12mL 20,12 mL 10.005 mL 10.005 mL

Jel yüzeyi izopropanol ile kaplanır.

45-60 dakika polimerize olması için beklenir.

Jel yüzeyindeki izopropanol dökülür.

Paketleyici (stacking) Jel Hazırlanması: %4.0, 0.125 M Tris, pH 6.8

Saf su 7.35 mL

1.5 M Tris-HCl, pH 6.8 1.25 mL

20% (w/v) SDS 0.05 mL

Akrilamid/Bis-akrilamid (%29.2/%0.8 w/v) 1.34 mL

%10 (w/v) amonyum persülfat 0.04 mL

TEMED 0.1 mL

Toplam monomer karışımı 10.13 mL

Paketleyici jel için monomer karışımı yukarıdaki tablo izlenerek hazırlanır.

Jel tarakları dikkatli bir biçimde polimerize olmamış karışım içine yerleştirilir.

Polimerizasyonun tamamlanması için 45-60 dakika beklenir

D.Örnek Hazırlanması

Protein örnekleri 10-40 μL’de yaklaşık 10-40 μg olacak biçimde, en az 1:4 oranında

örnek tamponu ile karıştırılır.

95 °C’de 2-4 dakika (veya 100 °C’de 1 dakika ) tutulur.

Elektroforetik Yürütme

Örnek yüklendikten hemen sonra sistem kapatılır ve elektrotlar bağlanır.

Örnekler ayırıcı jele girinceye kadar düşük akımda 100 Volt gerilim uygulanır.

Örnek ayırıcı jele geçtikten sonra ise gerilim 150-200 Volt’a çıkarılır.

İlk denemelerde voltaj değişimleri izlenir ve not alınır.

Brom fenol mavisi jelin alt ucuna varınca akım kesilir ve jel tanktan uzaklaştırılır.

Transfer için malzemeler

Tris 30 g

Glisin 144 g

SDS (%10) 20 mL

Distile su 800 mL’ye tamamlanır

Metanol 200 mL eklenir (kullanılacağı zaman) transfer gerçekleştirilir.

Bloklama

Transfer sonrası proteinleri bağlanmış olan membran 1.5 saat %5’lik süt tozu ve %0.1’lik Tween 20 içeren PBS çözeltisi (bloklama çözeltisi) içinde çalkalamaya bırakılır.

Bu süre sonunda membran 3 kez %0.1’lik Tween 20 içeren PBS çözeltisi ile 5 dakika

süre ile yıkanır.

Birincil antikor ile inkübasyon

Membran bloklama çözeltisi içinde dilüe edilmiş birincil antikor ile inkübe edilir. İnkübasyon süresi her antikor için ayrı olarak belirlenmiştir.

Bu süre sonunda membran 3 kez %0.1’lik Tween 20 içeren PBS çözeltisi ile 5 dakika süre ile yıkanır.

İ. İkincil antikor ile inkübasyon

Membran bloklama çözeltisi içinde dilüe edilmiş horseradish peroksidaz bağlı ikincil

antikor ile 1 saat oda sıcaklığında inkübe edilir.

Bu süre sonunda membran 3 kez %0.1’lik Tween 20 içeren PBS çözeltisi ile 5 dakika

süre ile yıkanır.

ECL ile görüntüleme

İkincil antikora bağlı bulunan horseradish peroksidaz enzimi, ECL çözeltisi içinde bulunan Lumigen PS-3 substratını katalizler. Bu reaksiyon sonucu açığa çıkan luminol ışımaya yol açar. Bu ışıma, Western blota özel filmler ile saptanır.

Volkswagen Binek Araç Bakım Periyotları 60.000 km / 90.000 / 120.000 km

Volkswagen Binek Araç Bakım Periyotları

  1. Polo
  2. Golf
  3. Golf GTI
  4. Golf R
  5. Yeni Scirocco
  6. The Bettle
  7. Yeni Jetta
  8. Yeni Passat
  9. Yeni Passat Variant
  10. Yeni Jetta
  11. Yeni Passat
  12. Yeni Passat Variant
  13. CC
  14. Tiguan

vosvogen bakımı

60.000 km / 90.000 / 120.000 km  (Binek Araçlar) Yapılan İşlemler
  • Motor yağı ve yağ filtresi değişimi
  • Polen filtresi ve klima filtresi değişimi
  • Hava filtresi değişimi
  • Yakıt filtresi suyunun alınması -gerekli ise
  • Motor sıvı kaçakları kontrolü, görsel kontrol
  • Soğutma sistemi, sıvısı, derece ve seviyesinin kontrolü
  • Cam silecek ve yıkama tesisatı ayar, seviye ve derece kontrolü
  • Kapı, kapak, menteşelerin ve sabitleyicilerin yağlanması
  • Ön ve arka fren balatalarının kontrolü
  • Fren sisteminin sızıntı ve hasar açısından gözle kontrolü
  • Fren sıvısının test aletiyle kontrolü
  • Egzoz sızdırma ve hasar kontrolü
  • Şanzıman, aks ve mafsal körüklerinin kontrolü
  • Lastiklerin kontrolü ve diş derinliklerinin ölçülmesi
  • Lastik havalarının kontrolü
  • Kontrol lambaları, aydınlatma, sinyal ve uyarı sistemlerinin fonksiyonel testi
  • Far ayarlarının kontrolü
  • Özel test cihazıyla sistemin test edilmesi
  • Servis aralığının sıfırlanması
  • Su tahliye kanalları (ön cam altı, açılır cam tavan vb.) kontrolü ve gerekirse temzilenmesi
  • Kapaklar ve kapılar açıkken iç ve dış tarafların görsel olarak hasar ve korozyon
  • açısından kontrol edilmesi
  • Deneme Sürüşü
  • Kalite Kontrol

  • Yakıt filtresinin değiştirlmesi: Dizel araçlarda bakım aralığına göre 20.000/30.000 km de,

  • Benzinli araçlarda ise 30.000 km de

  • V kayışı aşınma ve gerginlik kontrolü, gerekirse değişimi

  • Vites kutusu yağ ve seviye kontrolü

  • Bujilerin değiştirlmesi -benzinli araçlarda gereklidir. Bazı modellerde 30.000 km dir.

  • Triger kayışı değişimi ve gergi rulman kontrolü, gerekirse değişimi -dizel araçlarda her 90.000 –

  • 120.000 km de bir değişir

  • Servo direksiyon yağının kontrolü

  • DSG şanzımanlı araçlarda (mekanik kavramalılar hariç) 60.000 km de şanzıman yağ filtresi ve

  • şanzıman yağı değişimi

  • Haldex kavrama yağ değişimi (Yalnızca 4 çeker araçlarda uygulanır)

  • Triger kayışı değişimi (benzinli araçlarda her 90.000 / 120.000 / 180.000 km de birdeğişir)

vw bakım periyotları

Volkswagen Binek Araç Bakım Periyotları

Volkswagen Binek Araç Bakım Periyotları

  1. Polo
  2. Golf
  3. Golf GTI
  4. Golf R
  5. Yeni Scirocco
  6. The Bettle
  7. Yeni Jetta
  8. Yeni Passat
  9. Yeni Passat Variant
  10. Yeni Jetta
  11. Yeni Passat
  12. Yeni Passat Variant
  13. CC
  14. Tiguan

vosvogen bakımı

20.000 km /30.000 km veya yılda bir (Binek Araçlar) Yapılan İşlemler
  • Motor yağı ve yağ filtresi değişimi
  • Polen filtresi ve klima filtresi değişimi
  • Hava filtresi değişimi
  • Yakıt filtresi suyunun alınması -gerekli ise
  • Motor sıvı kaçakları kontrolü, görsel kontrol
  • Soğutma sistemi, sıvısı, derece ve seviyesinin kontrolü
  • Cam silecek ve yıkama tesisatı ayar, seviye ve derece kontrolü
  • Kapı, kapak, menteşelerin ve sabitleyicilerin yağlanması
  • Ön ve arka fren balatalarının kontrolü
  • Fren sisteminin sızıntı ve hasar açısından gözle kontrolü
  • Fren sıvısının test aletiyle kontrolü
  • Egzoz sızdırma ve hasar kontrolü
  • Şanzıman, aks ve mafsal körüklerinin kontrolü
  • Lastiklerin kontrolü ve diş derinliklerinin ölçülmesi
  • Lastik havalarının kontrolü
  • Kontrol lambaları, aydınlatma, sinyal ve uyarı sistemlerinin fonksiyonel testi
  • Far ayarlarının kontrolü
  • Özel test cihazıyla sistemin test edilmesi
  • Servis aralığının sıfırlanması
  • Su tahliye kanalları (ön cam altı, açılır cam tavan vb.) kontrolü ve gerekirse temzilenmesi
  • Kapaklar ve kapılar açıkken iç ve dış tarafların görsel olarak hasar ve korozyon
  • açısından kontrol edilmesi
  • Deneme Sürüşü
  • Kalite Kontrol

  • Yakıt filtresinin değiştirlmesi: Dizel araçlarda bakım aralığına göre 20.000/30.000 km de,

  • Benzinli araçlarda ise 30.000 km de

  • V kayışı aşınma ve gerginlik kontrolü, gerekirse değişimi

  • Vites kutusu yağ ve seviye kontrolü

vw bakım periyotları

Paypal Kart Nedir Nasıl Kullanılır Nereden Alınır

Alırken banka hesabı gerektirmeyen ön ödemeli bir karttır. Bankamatik kartı mantığıyla kullanılır. Kartın satıldığı yerlerden hemen para yükleyebilir zaman kaybetmeden kullabilirsiniz.  Paypal kartı Migros veya Teknosa mağazalarından alınabilir ve para yüklemesi yapılabilir. Para yüklemesi nakit yapılabildiği gibi kredi kartından da yapılabilmektedir.

peypal kart

Paypal kartı online olarak da ücretsiz kargo ile adresinize isteyebilirsiniz. Paypal karta yüklenen paraları  TEB bankamatiklerinden çekebilirsiniz. Kartı internet alışverişlerinizde veya kredi kartı bankamatik kartı kullanılan yerlerde kart şifresi ile kullanabilirsiniz.

Kart kaybolduğunda online hizmetlerden hemen kapatıp bulduğunuz zaman ise hesabı aktif edebilirsiniz.

Online hizmetleri kullanarak kart şifresini ve adres bilgilerini değiştirebilir, işlem geçmişini görebilir, bakiyenize bakabilirsiniz.

Paypal Nakit Kart Satılan Yerler

Migros,

D&R ,

Teknosa

ve seçili PTT şubeleri

Kart Ücretlendirme
Kart Satın Alımı

Kart satış ücreti : 5 TL (Kart alındığında ilk para yüklemesi yapılırsa para yükleme ücreti kesilmez)

Online kart alımı: Kart ücreti alınmaz. Kargo ücreti 4 TL alınır.

Para Yükleme

TEB ATM Ücretsiz

Migrosta yapılan yüklemelerde işlem başına 2 TL

PTT yapılan işlem başına %1 alınır.

Para Çekme

TEB ATM den nakit para çekme ücretsizdir.

TEB harici diğer ATMlerden çekilen para için işlem başına 5 TL ödenir.

Online Hizmetlerden kartını kullanıma açmak ve kapatmak ücretsiz

Para Çekme  LİMİTİ

Günlük: 300 TL

Aylık: 1000 TL

Yıllık: 2000 TL

Para Yükleme LİMİTİ

İşlem Başına: 300 TL

Yıllık: 5000 TL

PAYPAL Kart Türkiye’den Çekiliyor Mu?

LG G4 Özellikleri Kamerası Fiyatı İncele

LG rakiplerinin piyasayı elinde tuttuğu bir dönemde diğer markaların amiral gemilerine göre daha uygun fiyata piyasaya sürdüğü G2  ve G3 modelleri ile ( telefon ismi C2 C3 ifade edilse de doğru yazılışı LG G2, LG G3 ) akıllı telefon piyasasında ben de varım demeyi başarmıştı.

LG G4 modeli birçok yenilikle birlikte geldi. Bu yeniliklerden biri telefonun çok keskin olmayan ele alındığında telefonun daha rahat tutulması için tasarlanmış hafif bir kavis bulunuyor. LG G4 modelinde gelen yeniliklerden diğeri ise arka kapağın gerçek deri ve gerçek dikişlerden tasarlanmış olmasıdır. Arka kapağa dokunarak veya kokusunu hissederek gerçek deri hissini  alabilirsiniz.  Arka deri kapağın çıkartılabilir olması ilerde yıpranan derinin yerine yeni bir kapak takma imkanı sunuyor. Deri kapağın yanında plastik kapaklarda ürün G4 modelinde seçenekler arasında bulunuyor. seramik beyaz, metalik gri, parlak altın, kahverengi deri, siyah deri, kırmızı deri renkleri ile farklı arka kapak seçenekleri sunuyor. LG G4 deri kapağının nasıl yapıldığını görmek için tıklayınız.

lg c4 akıllı telefon deri dikişli kapak

Arka kapakta deri dikişlerinin bitiminde bulunan açma kapama tuşu ve ses tuşları G2 ve G3 modellerinde olduğu gibi biraz daha farklı tasarımla daha şık bir şekilde konumlandırılmıştır. LG G4 parlak bir görünüme sahip kenarlarında fiziksel bir tuş bulunmuyor. Telefon açma kapama ve ses seviye tuşları telefonun arkasına konumlandırlmıştır. Telefonun en   kalın kısmı 9.8 mm en ince kısmı ise 6.3 mm kalınlığında kavisli bir yapı bulunmaktadır. Telefonun üst kısmında da yanlarda olduğu gibi tuş bulunmuyor sadece telefonu kumanda olarak kullanabilme özelliği sağlayan kızılötesi (infrared) bulunuyor.  Kulaklık girişi ve micro USB 2.0 girişi ise telefonun alt kısmında bulunuyor. Micro USB 2.0 girişine slimport kablosu takılarak 4K görüntü aktarabilme imkanı sunuluyor.

Telefonun ekranına baktığımız zaman ise ekranın kenarlara oldukça yakın olduğu gözüküyor. Ekranın alt kısmında sana tuşlar bulunuyor. Bu sanal tuşlar ekran alanını biraz kısıtlasa da ekran büyüklüğü bu durumu tolare edebiliyor. Sanal home tuşuna basılı tutulduğu zaman doğrudan google açılıyor, yuvarlak home tuşunun yanında bulunan kare sanal tuşa basılı tutulduğunda ise uygulama ve widget ayarları, ana ekran ayarları, kilit ekran ayarları ve sistem ayarlarına gitme imkanı sunuyor.

LG G4 telefon hafızası önceki modellerinde olduğu gibi opsiyonel değil 32 GB dahili depolama alanı ile tek seçenek sunuyor. Dahili 32 GB depolama hafızasının yaklaşık 25 GB kullanılabilir durumda geriye kalan hafıza ise sistem ve uygulamalar için kullanılıyor. Eklenebilir hafıza ise 128 GB olarak belirtilse de bunun yanında ilerde artabilecek hafıza kartları ile 2 TB depolama alanına kadar  arttırılabilir bir hafıza ile oldukça iddialı oldukları görünüyor.  Ekranda bulunan ikonlar LG modeline has sade ve şık bir görünüme sahip bulunuyor. Bunun yanında telefon çok fazla yüklü uygulama ile gelmiyor. Çok fazla uygulama ile kullanıcılara boğmuyor.

LG G4 modelinde gelen kullanıcı dostu uygulaması olan smart notice uygulaması ekranda kullanıcıya günlük hava durumu bildirimleri gibi standart bildirimlerin yanında arka planda çalışıp çok fazla batarya tüketen uygulamaları da uyararak gösteriyor.

Kullanıcı dostu özelliklerinden birisi de wi-fi kablosuz internet bağlanma ayarları, evdeyken wi-fi ye gir evden çıkınca wi-fi den çık gibi özellikleri ile telefon dışardayken sürekli wi-fi ye bağlanmaya çalışmıyor. Buna benzer olarak kulaklığı takınca müziği açma özelliği ile tercihli özellikler sunuyor.

Arkada bulunan 16 MP kamerası oldukça ses getirdi. Kameranın yanında lazer otofokusu, led flashı ve renk spektrum ölçeri bulunmakta. Ultra HD 4K video çekim özelliği bulunan LG G4 kamerası ise en çok konuşulan özelliklerinden birisi olarak karşımıza çıkıyor. G4 diyafram değerindeki iyileştirmeler ile oldukça gelişmiş bir kamera sunuyor. G4 diyafram değeri f 1.8 ile oldukça kaliteli bir diyafram değerine sahip. Bu diyafram değeri ile düşük ışıklı ortamlarda kaliteli fotoğraflar çekme imkanı sunuyor. Diyafram neden önemlidir öğrenmek için tıklayınız

Arka tarafta bulunan lazer odaklanma ile çok hızlı fotoğraf çekme imkanı sunuyor. Hızlı açılan kamerada kolay kullanılabilen menülerle profesyonel fotoğraf ve video çekme imkanı sunuyor. Resim çekerken ön kısmı net çekip arka planı flu çeken profesyonel fotoğraf çekimine benzeyen bir sistemde kaliteli fotoğraf çekme imkanı sunuyor. Fotoshop programında çekilen fotoğrafları düzenlemek için fotoğraf kaydını raw jpg olarak kaydetme özelliği ile profesyonel kullanıcılar için bir alternatif sunuyor. Fotoğraf çekerken eli titreyenler için OIS (optical image stabilization) teknolojisi kullanan LG G4 görüntü bulanıklığını azaltan fotoğraf çekmeye imkan sağlıyor.

Qualcomm® Snapdragon™ işlemcisi bulunan LG G4 modelinde  Android™ 5.1 Lollipop işletim sistemi bulunmaktadır. LG G4 ekran boyutu 5.5 inç bu boyut interneti ve sosyal medyayı aktif kullanalar için ideal bir telefondur. Ekran çözünürlüğü ise Quad HD (2560 X 1440)  oldukça canlı ve gerçek bir görüntü sunmaktadır. In-cell Touch Display teknoloji kullanan LG G4 ekranın hızlı ve pürüssüz tekpi vermesini sağlamaktadır. Ön kamerası selfie severleri oldukça tatmik edecek bir kamera. 8 MP ön kamerası ile yüksek kalitede fotograf çekme imkanı sunuyor. Hareketle çekim ve tanıma özellikleri ile kolay ve eğlenceli selfiler çekilebilir. Arka kamerası ise 16MP Optik Görüntü Sabitleyici ve Otomatik Lazer Odaklanma / Çift Flaş içermektedir. Optik görüntü sabitleyici ile artık bulanık resimlerden kurtulabilirsiniz. Ultra-parlak lens bulunan kamerası ile düşük ışık yoğunluğunda ve portreler için profesyonel fotograflar çekebilirsiniz. Kızılötesine duyarlı renk spektrum sensörü fotograf çekilmeden önceki ortamdaki ışığı analiz eder ve böylece renklerin daha doğal ve daha gerçek olmasını sağlar.

Kablosuz Şarj imkanı sunan LG G4 3,000mAh  değiştirilebilir bataryası bulunmaktadır. Bu batarya diğer akıllı telefonlardan daha uzun süre bir pil ömrü sağlıyor.

lg c4 akıllı telefon çıkarılabilir pil

LG G4 internet üzerinden satın alabilecek yerler;

Avea

Bimeks

MediaMarkt

Teknosa

Turkcell

Vatan

Vodafone

LG G4 satış fiyatlarını görmek için lütfen tıklayınız

Katalitik Konvertör İkaz Işığı Neden Yanar

Yanmamış hidrokarbonlara bir daha yanma ve çevreyi kirleten gazlara bir indirgenme ortamı sağlayan bir sistemdir.

katalitik konvertör uyarı ışığı yanıyor ne demek

katalitik konvertör ikaz ışığı

Araçlarda katalitik konvertör ışığı yandığı zaman hava giriş çıkışı ile ilgili bir problem olabilir. Bunun sebeplerinden biri de bakımdan sonra takılan hava filtrelerinin yan sanayi olması veya hava filtresinin tamamen yerine oturtulmasından kaynaklanabilir.

Eğer problem bunlardan kaynaklanmıyorsa eksoz katalizörü tamir edilmelidir. Katalitik konvertörü kısa sürede tamir ettirmezseniz motora zarar vermez. Aracı katalitik konvertör ikaz ışığı yanarken kısa süreli kullanmakta zararı olmaz. Fakat uzun süreli kullanımda yaptırılması gerekir.