Kandan Total RNA İzolasyonu
kan mor kapaklı tüplere (hemogram tüpleri) alınmalı
alınan kan aynı gün içinde RNA izolasyonu yapılmalıdır. kan alındıktan sonra +4C de bekletilmelidir.
hemogram sonuçları olmalı
WBC sayısı en fazla 70 milyon olmalıdır.
lökosit sayısı oranlaması yapılmalıdır. bu oran için;
1 ul de 8 000 hücre varsa
x ul de 70 milyon hücre vardır
x= a ml
a ml kan alınıp üzerine 3a ml RBC lysis solution eklenir.
WBC sayısına bağlı olarak kullanılack olan solusyonlar kit protokolünde bulunuyor.
* alınan kanın 3 hacmi kadar RBC lysis solüsyonu eklenir. karıştır.
* oda sıcaklığında 10 dakika inkübasyon (arada karıştır)
* santrifüj 2 000xg 2,5 dakika (santrifüj sonrasında altta beyaz hücreler lökositler olmalı)
* RBC lysis solüsyonu ekle (kullanılan kanın 2 katı kadar- bu aşama RBC lerden tam olarak uzaklaşmak için gerekli)
* santrifüj 2 000xg 2,5 dakika at RT
* süpernatanı dök falkonu peçete üstüne ters çevir.
* falkonda kalan süpernatanı tüpün dibine değdirmeden pipetle al.
* kitin içinde lysis solusyonu var. B-merkaptoethanol eklenmeli (1 ml lysis- 10 ul B-merkaptoethanol: hazırlanan solüsyon 1 ay boyunca oda sıcaklığında saklanabilir )
* lysis(B-merk içermeli) solüsyonunu ne kadar ekleneceği kit protokolünde sayfa 14 de yazıyor.
* lysis eklendikten sonra pipetaj yap. (Bu kısım önemli, vortex yap ve sümüksü fazın akışkan halde olduğunu gör, eğer vortex aşamasından sonra akışkan bir şekilde pipete gelmezse üzerine lysis tamponu ekle)
* bu aşamada -20C de bekletilebilir (4 hafta)
* önce yeşil kolon kullanılır ve altta kalan sıvı alınır (kolon elek olarak kullanılır atıklar istenmeyenler üstte kalır)
* santrifüj 400 xg de 1,5 dakika at RT
* santrifüj bittikten sonra kolon 180 derece çevir tekrar santrifüj 400 xg de 1,5 dakika at RT
* altta kalan lyzatı byeyaz kolonun içine aktar.
* bu aşamada kolonun filtreli bölümüne isimler yazılmalı kolonun kapağına yazılması anlamlı olmaz
* santrifüj max xg de 1,5 dakika at RT
* santrifüj bittikten sonra kolon 180 derece çevir tekrar santr.
* 400 ul wash 1 ekle
* santrifüj 13 000 xg de 2,5 dakika at RT
* alt kısmı at kolonu temiz tüpe aktar
* 200 ul wash 2 ekle
* santrifüj 13 000 xg de 1,5 dakika at RT
TEKRAR
* 200 ul wash 2 ekle
* santrifüj 13 000 xg de 1,5 dakika at RT
ELUTION
* kolonu yeni tüpe aktar
* 50 ul elution buffer ekle
* * 200 ul wash 2 ekle
* santrifüj 13 000 xg de 1,5 dakika at RT
ALTTA KALAN KISIM TOTAL RNA -70 -80C ARASINDA SAKLANIR
İzole edilen total RNA – 80C de küçük hacimlerde saklanmalıdır.