Author Archives: incele.web.tr

Hyundai i10 Gösterge İkaz İşaret Anlamları

Motor soğutma suyu sıcaklığı uyarı ışığı (varsa) Motor soğutma suyu sıcaklığı 120 ± 3°C üzerine çıktığında uyarı ışığı yanar. Hararet yapmış bir motorla yola devam etmeyin. NOT Motor soğutma suyu sıcaklık uyarı ışığı yanarsa, bu motora zarar verebilecek aşırı ısınmayı gösterir.

Kapı açık uyarı ışığı Bu uyarı ışığı, kontak anahtarı herhangi bir konumdayken kapılardan birisi tam kapanmadığında yanar.

Motor yağ seviyesi uyarı ışığı (varsa) Motor yağı seviyesinin kontrol edilmesi gerektiğinde, motor yağ seviyesi uyarı ışığı yanar. Uyarı lambası yanarsa, motor yağı seviyesini mümkün olan en kısa sürede kontrol edin ve gerekirse motor yağı ekleyiniz. Bir huni kullanarak önerilen yağı yavaşca doldurunuz (Yağ ikmal kapasitesi: yakla- şık 0,6 ~ 1,0 lt.). Yalnız belirlenmiş olan motor yağını kullanınız. Motor yağını yağ seviyesinin yağ seviye çubuğundaki F işaretini aşmadığından emin olacak şekilde, taşırmadan doldurunuz.

Arka kapak açık uyarı ışığı Bu uyarı ışığı, bagaj kapısı güvenli bir şekilde kapatılmadığı zaman yanacaktır.

Düşük yakıt seviyesi uyarı ışığı Bu uyarı ışığı yakıt deposunun neredeyse boş olduğunu gösterir. Bu ışık yandığında, en kısa zamanda yakıt doldurulmalıdır. Yakıt Seviyesi Düşük Uyarı Işığı yanık durumda veya yakıt “E” işaretinin altındayken araç kullanılması, motorun düzensiz ateşleme yapmasına ve katalitik konvertör arızalarına yol açar (varsa).

Emniyet kemeri uyarısı (varsa) A Tipi Kontak anahtarını her ON (AÇIK) konumuna getirdiğinizde emniyet kemeri uyarı lambası kemerin takılı olmasını dikkate almaksızın, sürücü için bir hatırlatıcı olarak yaklaşık 6 saniye süreyle yanıp sö- ner. Kontak ON konumuna getirildikten sonra eğer sürücünün emniyet kemeri bağlı de- ğilse, emniyet kemeri uyarı ışığı yaklaşık 6 saniye boyunca tekrar yanıp söner. Kontak anahtarı ON (AÇIK) konumuna getirildiğinde sürücünün emniyet kemeri bağlı değilse ya da kontak anahtarı ON(AÇIK) konumuna getirildikten sonra kemer çözülmüşse, emniyet kemeri uyarı zili, yaklaşık 6 saniye süreyle çalar. Bu sürede eğer emniyet kemeri takılırsa, sesli uyarı hemen durur (varsa).

ECO göstergesi (varsa) (Otomatik şanzıman) ECO göstergesi, ekonomik olarak sürmenizi bilgilendiren bir sistemdir. Yakıt performansını iyileştirmenize yardım etmek için, ekonomik sürüş yaptığı- nızda görüntülenir. • ECO ON modunda ekonomik sürüş yaptığınız zaman, ECO göstergesi (yeşil) yanar. Göstergenin görüntülenmesini istemezseniz, TRIP düğmesine basarak ECO ON modunu OFF moduna çevirebilirsiniz. ECO ON/OFF modu işlemleri için, önceki sayfaya bakınız. • Yakıt verimliliği, sürücünün sürüş alış- kanlıklarına ve yol şartlarına göre deği- şebilir. • Ekonomik sürüşe uygun olmayan P (Park), N (Boş), R (Geri vites) veya spor modu sürüş konumlarında iş görmez.

EPB (Elektrikli El Freni) arıza göstergesi EPB arıza göstergesi kontak anahtarı ON konumuna getirildiğinde yanar, fakat yaklaşık 3 saniye sonra sönmelidir. Eğer uyarı ışığı yanmazsa ya da sürekli biçimde yanık kalıyorsa, aracınızı derhal HYUNDAI yetkili servisine kontrol ettirmenizi öneririz. ESC göstergesi ESC’nin düzgün çalışmadığını göstermek için yandığı zaman, EPB arıza göstergesi yanabilir, ancak bu durum EPB’de bir arıza var demek değildir

Motor yağı basınç uyarı ışığı Bu uyarı ışığı motor yağ basıncının düşük olduğunu gösterir. Eğer ışık sürüş esnasında yanarsa: 1. Aracı emniyetli şekilde yolun kenarına çekiniz ve durunuz. 2. Motor çalışmıyor iken, motor yağı seviyesini kontrol ediniz. Seviye düşükse, gerektiği kadar yağ ilave ediniz. Yağ ilave ettikten sonra uyarı ışığı hâlâ yanıyorsa veya yağ bulamazsanız, HYUNDAI yetkili servisi çağırmanızı öneririz.

AFLS (Adaptif Ön Aydınlatma Sistemi) arıza göstergesi (varsa) AFLS arıza göstergesi yanarsa, AFLS düzgün çalışmıyordur. En yakın emniyetli yere yanaşın ve motoru tekrar çalıştırın. Eğer gösterge sürekli açık kalıyorsa, bir HYUNDAI yetkili servisinde frenleri hemen kontrol ettirmenizi öneririz.

Immobilizer göstergesi (varsa) Bu gösterge, immobilizer anahtarı yerine takılıp, motoru çalıştırmak için ON konumuna getirildiğinde yanar. Bu sırada motoru çalıştırabilirsiniz. Motor çalıştıktan sonra ışık söner. Eğer bu ışık, motoru çalıştırmadan önce kontak anahtarı ON konumundayken yanıp sönüyorsa, sistemi HYUNDAI yetkili servisinde kontrol ettirmenizi öneririz.

Elektrik destekli direksiyon (EPS) sistemi uyarı ışığı (varsa) Bu gösterge ışığı, kontak anahtarı “ON (AÇIK)” konumuna getirildiğinde yanacak ve sonra motor çalıştıktan sonra sö- necektir. Bu ışık, EPS’de arıza olduğunda da yanar. Sürüş sırasında yanarsa, aracınızı kontrol edilmesi amacıyla HYUNDAI yetkili servisine götürmenizi öneririz.

Hız sabitleyici SET göstergesi Gösterge, hız sabitleyici kontrol düğmesi (-SET veya RES+) ON konumdayken yanar. Gösterge paneli üzerindeki hız sabitleyici SET göstergesi, hız sabitleyici kontrol düğmesine (-SET- veya RES+) basıldığı zaman yanar. Hız sabitleyici SET göstergesi, hız sabitleyici kontrol düğmesine (CANCEL) basıldığında ya da sistem devre dışı bırakıldığında yanmaz.

Hava yastığı uyarı ışığı (varsa) Bu uyarı ışığı, kontak anahtarını her ON konumuna getirdiğinizde, yaklaşık 6 saniye süreyle yanar. Bu ışık, İlave Güvenlik Sistemi (SRS) düzgün bir şekilde çalışmıyorsa da yanar. Hava yastığı uyarı ışığı, kontak anahtarı “ON” konumuna getirildiğinde veya motor çalıştırıldığında yanmaz veya 6 saniye geçtikten sonra bile sürekli yanıyorsa veya araç hareket halinde olduğunda yanarsa, sistemin kontrolü için HYUNDAI yetkili servisine başvurmanızı öneririz.

Motor arıza ışığı (MIL) – (Motor kontrol ışığı) Bu gösterge, emisyon kontrol sisteminin değişik unsurlarını izleyen Motor Kontrol Sisteminin bir parçasıdır. Eğer sürüş esnasında bu gösterge yanarsa, emisyon kontrol sisteminin bir yerinde olası bir arıza tespit edildiğini gösterir. Bu gösterge kontak anahtarı “ON” konumuna getirildiğinde yanacak, ve motor çalıştırıldıktan sonra birkaç saniye içinde sönecektir. Sürüş sırasında yanarsa veya kontak anahtarı “ON (AÇIK)” konumuna getirildiği zaman yanmazsa, sistemin kontrol edilmesi için HYUNDAİ yetkili servisine gitmenizi öneririz. Genel olarak, aracınızı sürmeye devam edebilirsiniz, fakat sistemi HYUNDAI yetkili servisine kontrol ettirmenizi öneririz. DİKKAT • Emisyon kontrol sistemi arıza gösterge ışığı yanarken uzun süreli araç kullanımı, sürülebilirliğe ve/veya yakıt ekonomisine etki eden emisyon kontrol sistemlerinin hasar görmesine neden olabilir. • Emisyon Kontrol Sistemi Arıza Gösterge Işığı yanmaya başlarsa, motorun güç kaybına neden olabilecek katalitik konvertör hasarı olasıdır. Sistemin, HYUNDAI yetkili servisine kontrol ettirilmesini öneririz.

Sinyal lambası göstergesi Gösterge paneli üzerinde yanıp sönen yeşil oklar sinyallerin gösterdiği yönü yansıtır. Oklar yanar, ancak yanıp sönmezse veya normalin üzerinde sıklıkla yanıp sönerse veya hiç yanmazsa, dönüş sinyal sisteminde bir arıza var demektir. HYUNDAI yetkili servisine başvurmanızı öneririz.

TPMS (Lastik Basıncı İzleme Sistemi) göstergesi (varsa) Düşük lastik basıncı göstergesi Düşük lastik basıncı göstergesi, kontak anahtarı “ON” konumuna getirildikten sonra 3 saniye süreyle yanar. Lastik Basıncı İzleme Sistemi’nde bir sorun olduğunda, düşük lastik basıncı göstergesi bir dakika kadar yanıp söndükten sonra sürekli yanar. Bu durum meydana gelirse, sistemi HYUNDAI yetkili servisinde kontrol ettirmenizi öneririz.

Ön ısıtma göstergesi sadece dizel araçlarda. Ön ısıtma göstergesi (Dizel motor) Kontak anahtarını “ON-açık” konumuna getirdiğinizde, gösterge ışlığı yanar. Motor, ön ısıtma gösterge ılığı söndükten sonra çalıştırılabilir. Bu uyarı ışığının yanma süresi; soğutma suyu harareti, hava sıcaklığı ve akünün durumuna göre değişir. ] NOT Ön ısıtma işlemi tamamlandıktan sonra, motor 2 saniye içinde çalıştırılmazsa, kontak anahtarını 10 saniye süreyle LOCK/OFF konumuna geri getiriniz ve sonra ön ısıtmayı tekrar etmek için yeniden ON konuma getiriniz.

Sürüş esnasında iki uyarı ışığı aynı anda yanıyorsa, aracınızın ABS ve EBD sisteminde bir arıza olabilir. Bu durumda, ABS ve normal fren sistemi düzgün çalışmayabilir. Sistemin, HYUNDAI yetkili servisine kontrol ettirilmesini öneririz. El freni ve fren hidrolik seviyesi uyarı ışığı Bu ışık kontak anahtarı ON konumuna getirildiğinde yanar ve el freni çekilmemişse, yaklaşık 3 saniye sonra söner.

El freni uyarı ışığı Bu uyarı ışığı, kontak anahtarı START veya ON konumundayken el freni çekildiğinde yanar. El freni bırakıldığında uyarı ışığı sönmelidir. Düşük fren hidrolik seviyesi uyarı ışığı Uyarı ışığı sönmezse, depodaki fren hidrolik seviyesinin düşük olduğunu gösterebilir. Uyarı ışığı sönmüyorsa:

1. Dikkatle en yakın emniyetli yere sürünüz ve aracı durdurunuz.

2. Motor çalışmıyorken, derhal fren hidrolik seviyesini kontrol ediniz ve gerektiği kadar hidrolik ilave ediniz. Sonra tüm fren parçalarını hidrolik sızıntısına karşı kontrol ediniz.

3. Eğer sızıntı bulursanız, uyarı ışığı sönmezse veya frenler düzgün çalış- mazsa aracı kullanmayınız. HYUNDAI yetkili servisine başvurmanızı öneririz. Aracınız ikili çapraz fren sistemi ile donatılmıştır. Bunun anlamı, ikili fren devrelerinden biri arızalandığında, diğer fren devresi ile hala frenleme yapabilirsiniz, demektir. İkili fren sisteminden sadece birinin çalışması durumunda, aracın durdurulabilmesi için fren pedalına daha fazla kuvvetle ve normalden daha uzun pedal kursu ile basılması gerekir.

Ayrıca, araç fren sisteminin bir miktar çalışması ile en kısa mesafede durmaz. Araç hareket halinde iken frenler arıza yaparsa, motor freni yapmak için vitesi küçültün ve aracı en kısa zamanda emniyetli bir bi- çimde durdurunuz. Ampullerin çalıştığını kontrol etmek için, kontak ON konumundayken el freni ve fren hidrolik seviyesi uyarı ışıklarının yanıp yanmadığını kontrol ediniz.

Auto Stop göstergesi (ISG) (varsa) Motor ISG (Idle Stop and Go) (Rölanti Dur ve Kalk) sisteminin Rölanti duruş konumuna girdiğinde, bu gösterge yanar. Otomatik çalıştırma meydana geldiğinde, gösterge panelindeki “auto stop” göstergesi 5 saniye için yanar söner. Daha fazla bilgi için, Bölüm 5’in ön tarafındaki ISG (Idle Stop and Go) (Rölanti Dur ve Kalk) sistemine bakınız. ] NOT Motor ISG sistemi tarafından otomatik çalıştığında, bazı uyarı lambaları (ABS, ESC, ESC OFF, EPS veya el freni uyarı lambası) birkaç saniye için yanabilir. Bu, düşük akü voltajı nedeniyle olur. Sisteminizde arıza olduğu anlamına gelmez.

hyundai kullanma kılavuzlarından gösterge ikaz detaylarını görüntülemek için tıklayınız.

Hyundai İ30 Gösterge İkaz Işıkları Anlamları İncele

Kapı açık uyarı ışığı Bu uyarı ışığı, kontak anahtarı herhangi bir konumdayken kapılardan birisi tam kapanmadığında yanar.

Arka kapak açık uyarı ışığı Bu uyarı ışığı, bagaj kapısı güvenli bir şekilde kapatılmadığı zaman yanacaktır.

1. Dikkatle en yakın emniyetli yere sürünüz ve aracı durdurunuz.

2. Motor çalışmıyorken, derhal fren hidrolik seviyesini kontrol ediniz ve gerektiği kadar hidrolik ilave ediniz. Sonra tüm fren parçalarını hidrolik sızıntısına karşı kontrol ediniz.

hyundai kullanma kılavuzlarından gösterge ikaz detaylarını görüntülemek için tıklayınız.

2015 Model Hyundai İ30 Style Design Pack İncelemesi için tıklayınız

FLOW CELL CYTOMETRY COMPENSATION

FLOW CELL CYTOMETRY COMPENSATION

Unlabelled boncuk (BD-comp beads beyaz kapaklı tüp) PMT voltaj ayarlarını yapmak için

İmmunglobulin kappa içeren boncuk (BD-comp beads mavi kapaklı tüp-antikor bağlanma bölgesi içerir)

Deneyde kullanılacak olan antikorlar ile ayrı ayrı muamale edilir

BOYALARIN HAZIRLANMASI

1.tüp: sadece unlabelled boncuk (beyaz kapaklı tüp) (bir damla)

2.tüp: unlabelled boncuk (bir damla) – IgK (bir damla) – kullanılacak antikor (deney miktarı ile aynı)

3.tüp: unlabelled boncuk (bir damla) – IgK (bir damla) – kullanılacak diğer antikor (deney miktarı)

Kullanılmayan parametreleri sil

Experiment

Compensation set-up

Create compensation control

Browser bölümünde çalışma dosyaları çıkmalı

Kaç parametre seçilirse bir fazla tüp çalışma tüpü oluşur

Grid oluşturulmalı (tabloların tamamı shift ile seçilmeli)

LOAD

FSC/SSC (PMT voltaj değerlerini) düzenle

Voltaj değerleri ile oynamak için ‘paramer’ kutusu açık olmalı

RECORD

Record tamamlanınca unload denir

BOYALARIN HAZIRLANMASI

Comp beads: iki tüp; biri negatif kontrol diğeri ise Ig K (antikor bağlanma bölgesi içerir)

1.tüp: sadece unlabelled boncuk (beyaz kapaklı tüp) (bir damla)

2.tüp: unlabelled boncuk (bir damla) – IgK (bir damla) – kullanılacak antikor (miktar ?)

3.tüp: unlabelled boncuk (bir damla) – IgK (bir damla) – kullanılacak diğer antikor (miktar ?)

Anti-mouse immunglobulin kappa: antikor bağlanma bölgesi vardır ve herhangi bir antikor ile bağlanabilir.

Antikor işlemlerinde ışıklı ortamdan kaçınılmalıdır ve antikor eklendikten sonra işlemler hızlıca yapılmalıdır.

Antikor ilavesinden sonra ve sıvı eklendikten sonra, inkübasyon işlemlerinden sonra vortex yapılmalı (bu işlem önemlidir)

Hazırlanan tüpleri vortex yap (medium-5 seconds)

İnkübasyon (karanlık, oda sıcaklığı, 20 dakika)

İnkübasyondan sonra vortex yap

1 ml cell wash ekle

Santrifüj (1200 rpm, 5 dakika, RT )

Santrifüj sonunda pelet gözükmeyecek, süpernatanı uzaklaştırırken pastör pipet kullan tamamen tüpün dibine kadar girme, her tüp için yeni pipet kullan kontaminasyona dikkat et

Vortex

500 Cell wash ekle (okutmak için eklenir, miktar değişebilir)

Flow Akım Hücre Ölçer Cihazında Analiz İşlemi İncele

Flow Akım Hücre Ölçer Cihazında Analiz İşlemi

Cihaz açılır

Damla kontrolü yapılır (Drop 1, sweat spot)

‘New experiment’ açılır

Kullanılmayan parametreler kaldırılır

‘compensation’ yapılır (yeni yapılır ya da link kullanılır)

‘Specimen’ seçilir (çalışılacak kadar tüp seçilir-isimlendirme/hücre sayım miktarı girilir)

‘Global sheet’ açılır (grafikler düzenlenir)

Örnek yüklenir

FSC/SSC ayarlanır

‘Record yapılır’

Analiz işlemi için event to record değeri 1000 den fazla seçilebilir. Bu işlemlerde sadece analiz yapılıp sort yapılmadığı için hücre kaybının (hücrelerin atığa gitmesinin önemi yoktur) fakat sort yapılacaksa ‘presort’ aşamasında ‘event to record’ değeri 1000 e ayarlanmalıdır.

FLOW Cell Sitometri Cihazı Kullanım Protokolü

FLOW Cell Sitometri Cihazı Kullanım Protokolü

Cihazı açmadan önce atık ve sıvı tanklarını kontrol etmelisin.Büyük tankın basıncını almalısın

Frequency : sıklık

Amplitude: Şiddet

Gap: ilk oluşan damla ile bir önceki damlanın arasındaki boşluğa denir

Drop 1: ilk serbest damlanın ortası ile en üst nokta arasındaki mesafe

Üst kısımda birbiri ile bağlantılı damlalar olmalı

Aşağıda ise bağımsız damlalar ve satelitleri net bir şekilde görülmeli

Drop 1yazan bölümün karşısına aynı değer yazılmalı

Freq, amp, drop 1 ayarı yapıldıktan sonra sweat spotu aktif hale getir.

Sweat spot: amplitude ve frequency ikonlarını inaktif hale getirir

Önce cihazı aç (bilgisayarı açmak için acele etme, 1-2 dakika bekle)
Bilgisayarı aç (bilgisayar tamamen açılsın kum saati resmi olmamalı, bilgisayarda işlemleri yavaş yapmalısın, hızlı başlatma donmalara sebep olabilir)
Use CST setting : kontroller pass durumundaysa

Keep current setting : önceki ayarlarkullanılmak istenirse

Cytometer

Start up

Cihaz yönlendirme yapıyor

CST (CYTOMETER SET UP AND TRACKING)

CST boncuğu ( +4 ^oC ) kullanmadan önce hafifçe karıştır (vortex yapma)

Sistem sıvısından 350 ul alıp falkon tüpüne aktar. Üzerine bir damla CST boncuk damlat

Tüpü hafifçe karıştır

Sweat spot açık kalsın (üzerinde düzeltme yapılabilir)

Cytometer

CST

*Alt köşede connected yazısını görmelisin.

Check performance

Lot ID (CST boncuğunun üzerinde yazar, farklı olmamalı, aksi takdirde bütün değerler hatalı olabilir)

LOT ID girilmeli

Configuration seç

RUN

Lot ID doğrulama yazısı

Sonuçları yazdırabilirsin (çıkan sonuçları dosyala)

Use CST setting: değerler pass verirse

Keep current setting: değerler pass vermezse

CİHAZ KAPATMA İŞLEMİ

Cytometer

Shut down

Stream kapalı olmalı (X)

Shut down

Nozzle çıkart ( yıkanmalı, peçete ile kurulama )

Closed loop nozzle tak (çok hassas tak)

Ethanole tak (büyük metal tankın basıncını almalısın)

Clean solution (distile su kullan)

File

Quit

Kapiller Elektroforez DNA Sekanslama

Genomik DNA kalıbının hazırlanması

Genomik DNA Standard yüksek moleküler ağırlıkta DNA izolasyonu protokolüne göre elde edilir.
Genomik DNA konsantrasyonu spektrofotometrik yöntemlerle belirlenir.
Ölçülen konsantrasyon değerine göre, genomic DNA steril, deiyonize su ile ya da 10 mM Tris, pH 8.0 ile dilüe edilir.

İnsan geni için: DNA 30 ile 60 ng/µl arasında olacak şekilde dilüe edilmelidir.

Dilüe edilen genomik DNA porsiyonlara ayrılıp -15°C/-25°C arasında saklanır.

Not: Tekrarlayan çözdürüp dondurma işleminden uzak durun.

DNA kalitesi, spektrofotometrede okunan A260 ve A280 değerlerinin oranlanmasıyla bulunur. (A260/A280)

Not: Yüksek kalite DNA, A260/A280 oranı 1.7 ile 1.9 arasında ölçülür.

PCR Amplifikasyonu

PCR Reaksiyonunun Hazırlanması:

Reaksiyon karışımı hazırlanır.

Reaksiyon karışımı hazırlanırken çalışılacak numune sayısı fazla ise ortak kimyasallar-PCR mastır mix,G/C enhancer gibi- tek tüpte mastır mix halinde hazırlanılabilir. Mastır miks için gerekli olan miktar numune sayısına göre hesaplanır ve eşit olarak pcr tüplerine dağıtılır.

Reaksiyona konulacak malzemeler:

PCR Mastır miks…………..…………….. 12,5 µl

PCR mastır miks içerisinde PCR reaksiyonu için gerekli olan MgCl2, dNTP, Taq Polimeraz ve tampon solüsyonu bulunmaktadır.

İleri (Forward) Primer………………… 2,5 µl

Çalışmada ilgilenilen genomik DNA bölgelerine özgü dizayn edilen ileri(forward) primer kullanılır.

Geri (Reverse)Primer…………………. 2,5 µl

Çalışmada ilgilenilen genomik DNA bölgelerine özgü dizayn edilen geri (reverse)primer kullanılır.

G/C Enhancer…………………………….. 5 µl

Genomik DNA dizisine primerlerin bağlanmasını kolaylaştırır.

Genomik DNA (30-60 µl)……………. 2,5 µl

Tüm kimyasallar eklendikten sonra pcr tüpleri kısaca vortekslenir. Tüm kimyasallar eklendikten sonraki toplam hacim 25 µl olmalıdır.

PCR tüpleri PCR Termal saykıl cihazına yerleştirilir.
Termal saykıl cihazına, aktivasyon, amplifikasyon ve elongasyon sıcaklık ve zaman ayarları yapılan deneye bağlı olarak kaydedilir. Aşağıda örnek ayarlar bulunmaktadır:

Aktivasyon: 1 döngü

95°C………………… 10’

Amplifikasyon: 40 döngü

95°C………………… 40’’

62°C………………… 1’

72°C………………… 50’’

Elongasyon: 1 döngü

72°C………………… 7’

Saklama:

4°C………………… ∞

DNA Miktarının Belirlenmesi

PCR reaksiyonu sonrasında ürün DNA miktarını belirlemek için 5 µl PCR ürünü DNAdan alınarak yükleme boyası ile karıştırılır ve önceden hazırlanan %2’lik agaroz jele yüklenir. Jelde boş bırakılan kuyucuklardan birine DNA markırı yüklenir. UV illüminasyon cihazında görüntüleme yapılır.

PCR Ürünlerinin Temizlenmesi

PCR reaksiyonu sonrasında pcr tüpleri, tüp çeperinde kalan olası ürünleri çöktürmek amacıyla kısaca santrifüj yapılır.

Elde edilen pcr ürününden farklı bir pcr tüpüne 5 µl konulur.
PCR reaksiyon artıklarını temizleme amacıyla, üzerine 2 µl işleme özgü bir enzim eklenir.
Toplam hacim 7 µL’dir.
Hazırlanan tüpler Termal Saykıl’a yerleştirilir ve kullanılan enzim çeşidine bağlı olarak hazırlanan kondisyonlarda cihaz çalıştırılır. Örnek kondisyonlar aşağıdaki gibidir:

Enzim inkübasyonu:

37°C………………… 30’

Enzim deaktivasyonu:

80°C………………… 15’

Saklama:

4°C………………… ∞

Sekans Reaksiyonunun Hazırlanması

PCR reaksiyon artıklarından temizlenen ürünler sekans reaksiyonu için hazırlanır. Sekans reaksiyonunda kullanılan malzemeler aşağıdaki gibidir:

Dye Terminator Miks ……………………. 2 µL
Sekans Tamponu ……………………. 2 µL
İleri(F) /Geri Primer(R) ……………………. 2 µL
PCR ürünü ……………………. 2 µL
Distile Su .…………………… 2 µL

Toplam hacim 10 µL’dir. Hazırlanan tüpler kimyasalların karışması için kısaca vortekslenip, santrifüjde çöktürülür ve Termal Saykıl cihazına yerleştirilir. Ornek termal saykıl koşulları aşağıdaki gibidir:

Aktivasyon:

96°C………………… 1’

Saykıl: 25 tekrar

96°C………………… 10’’

50°C………………… 5’’

60°C………………… 4’

Saklama:

4°C………………… ∞

Ekstensiyon ürünlerinin saflaştırılması

Ürünler SEPHADEX’li kolonlar kullanılarak saflaştırılır.

Kolonların hazırlanışı:

Sephadex’li kolonlara 750 µL ultra saf su eklenir.
Kolonlar toz Sephadex iyice çözünene kadar vortekslenir.
Kolonlar 30 dakika oda sıcaklığında bekletildikten sonra 2 dakika 4600 rpm de santrifüjlenir. Kolon içinde silindir şeklinde matriks gözlenir.
Kolon konteynerindeki toplanan suyun tamamen boşaltıldığından emin olunur.
Sekans ürünlerinin tamamı dikkatlice sephadex matriksin merkezine pipetle konulur.
Kolon tekrar 2 dakika 4600 rpm de santrifüj edilir.

Saflaştırılan ürünün Kapiller Elektroforez Dizi Analizi Cihazına Yüklenmesi

Kolon konteynerinde toplanan ürünün tamamı 96 kuyucuklu pleyte aktarılır.
Pleyt Septa ile kapatılır.
Pleyt cihaza ait olan pleyt tutucuya yerleştirilerek cihaza yerleştirilir.
Kapiller elektroforez sonrası elde edilen data yorumlanır.

SDS POLİAKRİLAMİD JEL ELEKTROFOREZİ (SDS-PAGE) İncele

SDS POLİAKRİLAMİD JEL ELEKTROFOREZİ (SDS-PAGE)

En yaygın kullanım alanı olan elektroforez tipidir. Jel sentetik bir madde olan akrilamid ile akrilamid türevi olan N-N’-metilen bisakrilamidin polimerleşmesiyle oluşturulur ve örnekler bu jel üzerinde yürütülür. Proteinler için çok uygun olduğu gibi DNA ve RNA elektroforezleri için de kullanılabilir. Akrilamid miktarı ve akrilamid/bisakrilamid oranı jelin ayrıştırma kapasitesini belirler. Akrilamid / bisakrilamid oranı yükseldikçe jellerde ısınma fazlalaşır, kırılganlık artar, daha kolay yıkanır.

PAGE sisteminde uygulama sınırları (proteinler için)

Jel yüzdesi Ayrışma Kapasitesi

%5 60,000 – 212,000

%10 18,000 – 75,000

%15 15,000 – 45,000

Polimerleşme reaksiyonunda akrilamid molekülleri yanyana bağlanarak düz zincirler oluştururlar. Bisakrilamid molekülleri ise iki akrilamid zinciri arasında çapraz bağlanmalar oluşturur. Böylece ağımsı bir yapı meydana gelir.

Polimerleşme derecesi;

sıcaklık,
pH,
amonyum per sulfat (APS) ve
N,N,N’,N’- tetrametil-etilendiamin ( TEMED)

miktarına göre farklılık gösterir.

Polimerleşme için serbest radikal oluşumuna sebep olan amonyum per sulfat (APS) reaksiyon başlatıcı, TEMED ise katalizör olarak rol oynar.

SDS ( Sodyum dodesil sülfat) anyonik bir deterjan olup iki amino asitte bir peptit zincirine bağlanarak protein moleküllerini oluşturan alt birimleri biribirinden ayırır. Ayrıca (-) yük taşıdığından peptitlerede yüksek oranda (-) yük kazandırır. Böylece elektrik yükü açısından karışım içerisindeki bütün protein molekülleri eşit duruma getirilir. Jel konsantrasyonu arttırılarak protein moleküllerinin molekül ağırlıklarına göre ayrışmaları sağlanır.

SDS PAGE yöntemi proteinlerin saflığının kontrolü, molekül ağırlıklarının saptanması ve konsantrasyon çeşitliliğinin belirlenmesi amacıyla kullanılmaktadır.

Jelin Hazırlanışı

Poliakrilamid jeli ya iki cam tabakası arasında (slab) ya da ince uzun tüpler içerisinde hazırlanır. Günümüzde en yaygın kullanımı slab jeldir. Slab jelin avantajları, az madde harcanması, pratik oluşu ve örneklerin yan yana karşılaştırılmaları açısından daha kullanışlı olmasıdır.

Cam tabakaların iki yanına jelin arzu edilen kalınlığı ölçüsünde, genellikle teflondan yapılmış birer “spacer” yerleştirilir. Jel ne kadar ince ise resolüsyon o kadar iyi olur (0.5 – 1 mm). Camlar kıskaç yardımıyla sıkıca tutturulur. Jelin alt kısmının geleceği yere yine aynı kalınlıkta teflondan yapılmış dip “spacer”ı yerleştirilir ve kıskaç yardımıyla sıkıştırılır. “Spacer” ve cam tabakalar arasındaki jelin sızıntı yapmasına sebep olabilecek olası boşlukları izole etmek için, tabakanın kenarlarına bir pastör pipeti yardımıyla agaroz çözeltisi dökülür ve kuruması beklenir (yeni sistemlerde bunu yapmadan doğrudan distile su ile kontrol yapılabilir). Herhangi bir sızıntının olup olmadığı su ile kontrol edilir. Sızıntı olmadığından tamamen emin olunduktan sonra jel karışımı ileride belirtildiği gibi hazırlanarak, genellikle bir enjektör yardımıyla hava kabarcığı oluşturmadan boşaltılır.

Jel polimerleşirken su çıkışı olur. Çıkan su yüzeyde birikir ve kurumaya maruz bırakılırsa jel yüzeyinin bozulmasına neden olur. Bu nedenle jel polimerleşmek üzere doldurulduktan sonra üzerine pastör pipeti yardımıyla ve yavaşca bir miktar distile su (n-butanol veya isopropanol) konmalıdır. Böylece hem yüzeyin kuruması önlenir hem de jel yüzeyinin daha düzgün olması sağlanır. Polimerleşme başladıktan sonra ilk 15 dakika içinde %75’e erişir. Polimerleşme gerçekleştikten sonra jelin üst kısmındaki su (n-butanol veya isopropanol) alınarak yerine jeldeki derişimine eş değerde tampon konur ve polimerleşmenin tamamlanması için bir saat bekletilir. Eğer jel karışımı içinde (özellikle % 10 ve üzerindeki yoğunluklardaki jellerde) fazla miktarda çözünmüş hava varsa, polimerleşme sırasında bu hava, kabarcıklar halinde jel içinde kalır ve jel yapısını bozar. Bu nedenle jele TEMED eklenmeden önce vakumlanarak havası alınmalıdır. Sıkıştırma jeli kullanılıyorsa, sıkıştırma jelinin polimerleşmesi tamamlandıktan sonra örnekler hemen uygulanır. Uzun süre beklenirse iki jel arasındaki derişim ve pH farkı ortadan kalkacağından sıkıştırma jelinin fonksiyonu tam olarak gerçekleşmez.

Resolving Gel

%7 %10 %12 %15

H2O 15,3 ml 12,3 ml 10,2 ml 7,2 ml

1,5 M Tris-HCL pH 8,8 7,5 ml 7,5 ml 7,5 ml 7,5 ml

20% (w/v) SDS 0,15 ml 0,15 ml 0,15 ml 0,15 ml

Acrylamide/Bis-acrylamide 6,9 ml 9,9 ml 12,0ml 15,0 ml
(30%/0.8% w/v)

10% (w/v) ammonium persulfate 0,15 ml 0,15 ml 0,15 ml 0,15 ml
(APS)

TEMED 0,02 ml 0,02 ml 0,02 ml 0,02 ml

Stacking Gel Solution (4% Acrylamide):

H₂O	3.075 ml
0.5 M Tris-HCl, pH 6.8	1.25 ml
20% (w/v) SDS	0.025 ml
Acrylamide/Bis-acrylamide (30%/0.8% w/v)	0.67 ml
10% (w/v) ammonium persulfate (APS)	0.025 ml
TEMED	0.005 ml

Pyromark PCR Kras Braf Çalışması İncele

PYROMARK

Çalışılan parametreler;

KRAS: 12-13, 61 primer miksi kullanılır.

BRAF: V464- 469, V600 iki primer miksi kullanılır.

Deney basamakları:

DNA hazırlanışı
1. DNA miktar belirleme
PCR hazırlanışı
Pyro station work , pyro sekans cihazı programı , holderların hazırlanması
Bilgisayarda çalışma kağıdı hazırlama
Hibridizasyon-Streptavidin
Cihaza yükleme
Analiz

PCR hazırlanışı

Her çalışmada ayrı tüplerde aşağıdakiler hazırlanır.

Hasta örneği
Wild type control
Non template control ( örnek yerine su koyuyoruz)

Her çalışmada kodon 12-13 ve kodon 61 için ayrı ayrı hazırlık yapılmalıdır. Dolayısıyla her örnek için 2 PCR tüpü hazırlanmalıdır. 3 örneğimiz olduğu için ( Hasta örneği, Wild type control, No template control ) 6 PCR tüpü alınır.

Hasta 12-13 Control 12-13 NTC 12-13

Hasta 61 Control 61 NTC 61

Öncelikle ayrı bir tüpe mixture hazırlanacak. İçine;

Pyromark PCR master mix (12.5 µl x3 tüp için)

İlgili PCR primeri (Kodon 12-13, ve Kodon 61 için ayrı ayrı) (1µl x3 tüp için). BU AŞAMADA DİKKAT: PCR primerleri ile sekans primerleri farklı olduğu için karışmamalı. H₂O (6.5µl x3 tüp için)

Sonra PCR tüplerine 20 µl dağıtılır.

İçlerine hasta örneği olan tüplere 5µl DNA (15-30 ng/ul)
Wild type control örneği olan tüplere 5µl Wild type control konulur.
No template control örneği olan tüplere de 5µl su koyulur. Kitin içinden çıkan su kullanılır. 18.2 ohm olmalı.

DNA dilüsyonu yaparken de yarıya düşerek yaparsak DNA örneğimiz daha az bozulur.

Wild type control konsantrasyonu da 2ng/µl olmalıdır.

Mutlaka kitten çıkan distile su kullanılmalıdır.

THERMAL CYCLER: Bütün çalışmaların PCR protokolü aynıdır.

95°C for 15 min

Number of Cycles : 1

95°C for 20 sec

53°C for 30 sec

72°C for 20 sec

Number of Cycles : 42

72°C for 5 min

Number of Cycles : 1

4°C for 5 min

Number of Cycles : 1

KRAS çalışması için kit iki kutudan oluşur;

Kodon 12-13 ve kodon 61 PCR primerleri ve seq primerleri vardır. PCR ve seq primerleri farklıdır.

İlk önce PCR primerleri kullanılır.

Turuncu kapaklı thermal PCR mix vardır.

Wild type kontrol her çalışma için kullanılmalıdır.

+4 kutusunda; PCR sonrası işlemler için kullanılır.

PCR hazırlamak için kullanılması gereken tüpler;

Kartuş temizliği önemli; pudrasız eldiven kullanılmalı, filtresiz uç kullanılmalı.

Pyro station work , pyro sekans cihazı programı, holderların hazırlanması

A.kartuş hazırlığı :

kartuşun üzerine tamamen su konulur. Kullanılan su deionize olmalı. Kartuş kontrolu deneye başlamadan önce yapılmalıdır.

Yazı bize bakacak şekilde; en arka 3 lü kuyucuklara, sağ orta, alt orta ve sol orta kısmına baskı uygula ve suyun alttan çıktığını görülür . Su geliyorsa sorun yok her şey yolunda. Su gelmezse bu işlemi tekrarlamalısın.

HER ÇALIŞMA SONRASINDA KARTUŞ 4 KEZ ULTRA PURE SU İLE YIKANMALIDIR.

+4 derece sekans solüsyonları ile sekans hazırlığı:

Çalışmaya başlamadan önce vacum station hazırlanmalıdır. H₂O -2 haznesine biraz su konulur. Güç kaynağı ve vacum bölümündeki düğmeler açılır.

H₂O -2 haznesinde bulunan suyun tamamı çekilir. Her filtrenin aynı anda çektiğinden emin olmak için kostar pleytlerine su konulur ve her bir filtrenin çekişi kontrol edilir. Her bir filtre aynı anda çekilmelidir. Eğer bir sorun olursa çalışmayan filtre yenisi ile değiştirilir.

Ethanol (70%) ucucu olduğu için kullanılacağı zaman vakum hazneleri konulmalı. Diğer haznelere uygun solüsyon içeren plastik banyolar oturtulur.

PCR ÜRÜNLERİNE STREPTAVİDİN BOYASI BAĞLANMASI

STREPTAVİDİN: 2 ul

BINDING BUFFER: 40 ul

DEIONIZE WATER (18.2 ohm) : 28 ul

ÖRNEK BAŞINA KULLANILAN MİKTAR. KAÇ ÖRNEK ÇALIŞILACAKSA +1 eklenir.

Streptavidin opak bir maddedir köpürmemesi için çalkalanmamalıdır. Streptavidin yatay eksende çevirerek , yavaşça karıştırılır.

Daha sonra 6 tüplük PCR ürünü için tek bir ependorf tüpüne binding solüsyonu ile karıştırılarak hazırlanır:

Streptavidin 2ul x 6 = 12 ul ( 6 tüp için)

Binding buffer 40ul x6 =240ul ( 6 tüp için)

Deiyonize ultra pür su 18,2 ohm 28 ul x6 =168ul (6 tüp için)

Kit içinden çıkan şeffaf plate ‘e uygun kuyucuklara 70 er ul pipetlenir. Bu aşamada 0.3 fazla örnek düşünülerek çalışılmalıdır

PCR ürünleri pyro bilgisayar ( bkz pyro bilgisayar programı hazırlama ) programında oluşturduğun tabloya göre streptavidin karışımı üzerine 10 ul pipetlenir.

Plate in üzeri seal ile iyice kapatılır. Holder alınır ve 1400 rpm de 10 dk oda ısısında çalkalanır. 10 dakikadan az olmamalıdır.

SEKANS MİX HAZIRLANMASI

Kodon 12.13 ve kodon 61 için iki ayrı ependorf tüpüne mix hazırlanır.

Pyromark annealing buffer 24,2 ul x3 ( 3 tüp 12.13 veya 61 için ayrı ayrı )

Sekans primeri 0,8 x3 ul (12.13 veya 61 için ayrı ayrı)

Ayrı bir plate e hazırlanan sekans mix 25 er ul uygun kuyucuklara pipetlenir.

iki bölge çalışılacaksa iki epfendorf tüpü çıkar. Ayrı ayrı miks hazırla.

Her tüpün ismini dikkatlice oku. Hata yapma. Tüplerin üzerlerine isimlerini yaz.

Pipetaj yapabilirsin. Vorteks yapılabilir. Daha sonra quick spin yap.

Q24 plate lere 25 ul dağıtılmalı.

Q24 plate başlangıç yönüne dikkat edilmeli. Kesik kenarlı kısımdan başlanmalı. Yönler karıştırılmamalı.

Bilgisayarda hazırlanan çalışma listesi nasıl hasırlanmışsa o şekilde primer miksleri dağıtılmalı.

Q24 plate primer miksleri eklendikten sonra workstationda kendi yerine konulmalıdır.

WORK STATION DA VAKUM ÇALIŞMASI

Streptavidinli PCR ürünleri shaker dan alınır work stationda ön sol tarafa , sekans master mix li plate ise ön sağ tarafa yerleştirilir.

Vakum cihazı açılır ve birkaç dakika bekletilir.

PCR ürünleri üzerindeki seal açılır, vakum ile sıvılar çekilir.

Daha sonra sırası ile PCR ürünleri çekilen vakum tarağı :

Sırası ile 5 sn etanol , 5 sn denaturasyon sıvısı , 10sn pyromark buffer solüsyonlarından geçirilir.

Zamanlama hortumdan sıvı geçişi olduktan sonra 5 e veya ona kadar sayılarak yapılır.

Daha sonra vakum tarağı ters çevrilir ,önce vakum cihazı sonra tarak kapatılır.

Tarak sağ tarafta bulunan sekans plate e daldırılır ve hafifçe sallanır.

Workstation işlemi bittikten hemen sonra temizlik yapılmalıdır.

H20-1 su kısmından hafif karıştırarak sıvı çektir.

H20-2 su ksımının tamamı çektirilir.

Plate 80 dereceye gelen ısıtıcıda ( holderda) 4 dk bekletilir.

Diğer holder 4 dereceye buzdolabına koyulur,

80 derecede 4 dk bekletilen plate buzdolabında ki holdere koyulur 4 derecede 15 dk bekletilir.

Plate 15 dk sonunda pyro cihazına yerleştirilir, okutulur.

Bu aşamada cihaz kartuşu hazırlanabilir.

Kartuş yüklerken filtresiz pipet ucu kullanmalısın.

Bilgisayardan alınan çıktıya göre hazırlama yapılır.

E-mix ve S-mix -20C de saklanır. Karanlıkta saklanmalı. Alimünyum folyo ile kapalı olmalı.

Kartuşa enzim ve substratı ekle

Nükleotidleri olması gereken yerlere ekle.miktarları kontrol et. Nükleotidler farklı miktarlar olabilir

CİHAZDA PROGRAM HAZIRLAMA

Cihaz ile bilgisayar arasında doğrudan bir bağlantı yok. Bilgisayarda program hazırlandıktan sonra USB ile cihaza yüklenir.

PyromarkQ24 programı açılır.

METHOD AYARLARI KARTUŞ ÜZERİNDEKİ DEĞERLER İLE AYNI OLMALIDIR.

HASTA ADI YA DA AÇIKLAMA YAZILABİLİR.

Bu tablo PCR ürünlerinin plateki yerleri ile aynı olmalıdır.

BU DOSYAYI USB İLE PYRO SEQ CİHAZINA AKTAR.

USB DE BULUNAN DOSYA CİHAZDA AÇILIP HERŞEY HAZIRLANDIKTAN SONRA ÇALIŞTIRILIR.

MASTER MIX SOLUSYONUNU VORTEX YAPMA.

MIX DAĞITIRKEN HOMOJEN DAĞITMAYA DİKKAT ETMELİSİN.

Alınan çıktıdaki solusyonlar ve değerler kartuşa dikkatli bir şekilde yüklenir.

Önce enzyme mix koyabilirsin.

Solusyonlar kartuşa yüklenip hemen cihaza konulur.

NUKLEOTİDLER +4 C DE KALMALI KESİNLİKLE -20C DE OLMAMALI

Pyromark analiz :

Pyromark Q24 programı çalıştırılır.

Analiz cihazındaki flaştaki bilgi yüklenir.

Analiz açılır.

Mavi renk çalışma düzgün,sonuç verilebilir,

Kırmızı çalışmamış,sonuç verilemez,

Sarı bir hata olduğunu gösterir, DNA yoğunluğu az olabilir.

İnceleme tablaya bakılarak kontrol eldir.

Wild type codondaki değişiklikleri bize gösterir. LOD değerlerine göre değerlendiririz.

Kodon 12-13 için anlizi incelersek:

Bizi mavi kutudaki yüzdeler ilgilendiriyor. Bu yüzdeleri tablodaki LOD değeri ile karşılaştırıyoruz. Eğer LOD değerinden düşük ise sorun yok; yüksek ve 4.7 yi geçmemiş ise tekrar çalışılmalı; 4.8 ve yüksek ise mutasyon sonucu verilmelidir.

Öncelikle pik uzunluğu bağlanan nükleotid sayısı ile doğru orantılıdır.

Bu GGT diye okunur.

Cihaz bize hep ikinci nükleotidin değişim değerlerini verir. G(G)T. Bu codonun değerleri incenir.

Ancak ilk G değerleri de incelenmelidir.

PyromarkQ24 Kit kutularının içindekiler:

Küçük kutu( -20de saklanacak )

– Pyromark PCR Master Mix

– Unmethyloted Human Control DNA

– Coralload Concentrate

– PCR Primer Mix Kras 12/13

– Seq Primer Kras 12/13

– PCR Primer Mix Kras 61

– Seq Primer Kras 61

– H2O

Büyük kutu( +4de saklanacak )

Binding Buffer
Anneling Solution
Wash Buffer
Subtrate Mix ( Açıldıktan sonra -20 )
Enzyme Mix (Açıldıktan sonra -20 )
dATP
dCTP
dGTP
dTTP

Streptavidin ( Vorteksleme ) ( +4de saklanacak )

Akım Hücre Ölçer Nozzle Bakımı İncele

Her nozzle için CST yapılmalı
Her çalışmadan sonra nozzle temizliği yapılmalı
Nozzle temizliği için ultrasonik banyo kullanılmalı
Nozzle üzerinde bulunan contaya dikkat edilmelidir
Nozzle peçete vb. ile silinmemelidir
Temizleme işleminden sonra üzerindeki su kendiliğinden uzaklaşması beklenmeli
Nozzle deliğine iğne ucu sokulmamalı

Gen Klonlama İnceleme

Moleküler biyologlar, canlı hücredeki moleküllerin, hücre yapısı ve fonksiyonuna nasıl katıldıklarını anlamak isterler. Proteinler hücrenin yapı taşlarını oluştururlar ve bunlar da genlerin ürünüdürler. Moleküler biyologlar dikkatlerini, proteinlerin yapı ve fonksiyonlarını veya onları kodlayan genlere odakladılar.

Ökaryotik türlerde, bir hücre binlerce farklı protein oluşturur. Bunların hepsinin üstesinden gelmek oldukça zordur. Bu yüzden genleri tek tek ele alarak çalışmak daha kolaydır. Bunun içinde en iyi yöntem o proteini kodlayan genin klonlanmasıdır.

Gen klonlama: Bir genin birçok kopyasını oluşturma ve izolasyonunu ifade eder. Bir genin klonlanması için gerekli laboratuar yöntemleri 1970 lerde bulunmuştur. Bu tekniklerin geliştirilmesiyle bulunan yöntemler hücre biyologları, biyokimyacılar, bitki biyologları, mikrobiyologlar ve biyoteknologlar tarafından kullanılmıştır.

Klonlama çalışmaları 2 DNA molekülünü kapsar.

1- Kromozomal DNA

2- Vektör DNA

Gen klonlanmasında genin kaynağı geni taşıyan türün kromozomal DNA sıdır. Kromozomal DNA yı hazırlamak için ilk olarak organizmadan hücresel doku elde edilir. Kromozomal DNA nın hazırlanması için hücrenin parçalanması, DNA nın çıkartılması ve saflaştırması için biyokimyasal yöntemler uygulanır.

tip DNA ise vektör DNA olarak bilinen özel DNA parçasıdır. Vektör DNA nın amacı klonlanacak olan DNA parçasının taşınmasında görev yapmaktır. Vektörün en büyük özelliği içinde bulunduğu hücrede (konak hücre) çoğalabilmesidir. Böylece taşıdığı gen de onunla birlikte çoğalacaktır.

VEKTÖR DNA

Gen klonlamasında kullanılan aracı moleküllere vektör denir. Vektörler konakçı organizmada, konakçı organizmadan bağımsız olarak replikasyon (çoğalma) gösterirler. Bakteri DNA’sı harici kendi kendien replike olabilen minikromozomlardır.

BAŞLICA VEKTÖRLER

Plazmidler
Bakteriyofajlar
Kosmidler
Bakteri yapay kromozomları (BAC)
P1 kökenli yapay kromozomlar (PAC)
Maya yapay kromozomları (YAC)
Memeli yapay kromozomları (MAC)
İnsan yapay kromozomları (HAC)

Doğal olarak bulunan plazmitler büyük ve kullanışsız olduklarından, bunların yerine in vitro ortamda amacına yönlik olarak hazırlanan yapay plazmid vektörler kullanılmaktadır. Üzerlerinde ampisilin, tetrasiklin, kanamisin gibi antibiyotiklere karşı direnç genleri taşırlar. Bunlar seleksiyonda önemli fonksiyonu olan marker genlerdir. Plazmid vektör 10 kb yabancı DNA alabilir.

Bakteriyofajlar

Faj’lar bakteriyi enfekte eden virüslerdir. Fajların bazıları, kendi konakçılarında lizis meydana getirmelerine karşın, bir kısmı da bakteri içinde bulunduğu halde herhangi bir zararlı etkide bulunmazlar.

Bu tür fajlar bakterinin genomu ile birleşir, onun bir devamı haline gelir, onunla birlikte eş zamanlı olarak replike olur ve her hücre bölünmesi sırasında da, bakteri DNA’sı ile birlikte kardeş hücreye aktarılır.

Kosmidler

Kosmid vektörler, bir bakteriye ait ve replikasyon orijin bölgesine sahip plasmidle, buna birleştirilmiş lambda fajı yapışkan ucundan (cos, cohesive ends) oluşturulmuşlardır (hibrit vektörler).

Tek cos bölgeli kosmid vektörler: Bu vektörler için lambda fajının lineer faj DNA’sındaki cos bölgeleri RE’lerle kesilerek çıkarılır. Bunlar, pBR322 plasmidinin tetrasiklin geni içine integre edilir ve böylece tek bir cos bölgesine sahip kosmid vektör elde edilir.

Böyle bir kosmid yaklaşık 6 kb uzunlukta olup, yapısında plasmide ait replikasyon orijini (RO) ,ampr geni ve lambda fajının cos bölgesi bulunur. Bu tarzda hazırlanan kosmid yaklaşık 35-40 kb uzunlukta yabancı bir geni kabul edebilir ve aktarabilir.

Çift cos bölgeli kosmid vektörler: İki cos bölgesine ve iki markere (ampr, kanr) sahip vektörlerdir. Kosmidler iki RE ile aynı anda kesildiğinde iki lineer parça elde edilir ve her birinde bir cos bölgesi ve bir marker bulunur. Yabancı gen DNA’sı, iki cos bölgesi arasına integre edilir. diğer işlemler aynen tek cos bölgeli kosmidde olduğu gibi yürütülür.

Mekik (shuttle) kosmid vektörler:

Bu tarzda dizaynı yapılan vektörlerde cos bölgeleri ve markerleri yanı sıra prokaryotik ve ökaryotik hücrelere ait genetik DNA sekansları da bulunur. Bunlar da 35-40 kb’lık yabancı DNA’yı kabul edebilir ve transferini sağlayabilir.

Bakteri yapay kromozomu (BAC)

Farklı türlerden alınan 100,000 ile 200,000 baz büyüklüğünde DNA parçalarının bakteride klonlanması ile olur. Klonlandığı zaman hücre içinde birçok kopyası olur. BAC vektörleri doğal olarak var olan büyük bakteri plazmidi F-faktör üzerine kurulurlar. BAC vektörleri büyük DNA fragmentlerini klonlamada ve özellikle büyük genomların sıra dizilerinin eldesinde kullanılırlar.BAC vektörü 300kb’a kadar yabancı DNA’yı içine alabilir.

Maya yapay kromozomu (YAC)

Çok büyük DNA (200-500 kb veya 1–2 Mb ) fragmentlerini kabul edebilir. Bir kromozomun önemli öğeleri olan telomerleri, sentromeri ve replikasyon başlangıç noktasını içerirler. Oldukça kararlıdır ve insan genomunun haritalanmasında, genomik kütüphanelerin yapılmasında etkili bir şekilde kullanılır.

Memeli yapay kromozomu (MAC)

Memeli yapay kromozomları, kromozomların fonksiyonel bölgelerini (sentromer,telomer,replikasyon orijini) taşıyan ve hücreden bağımsız olarak çoğalabilen moleküllerdir.MAC yüzlerce kb büyüklüğünde genomik DNA taşıyabilir.

MAC oluşumu en yakın örnek olan YAC’a göre çok daha zordur.Çünkü memeli telomeri maya telomerinden 10-100 kat; memeli sentromeri ise maya sentromerinden yaklaşık 1000 kat daha büyüktür.Memeli sentromer ve telomer dizilerinin çok fazla sayıda tekrarlanması da memeli yapay kromozomu oluşturulmasını zorlaştırır. Bunlar hem E. Coli, hem de ökaryot alıcıda çoğalan shuttle vektörlerdir. Virüsten gelen ökaryotik replikasyon orjini taşırlar (SV40).

Klonlanan genin promoter dizisi ve transkripsiyon terminasyon sinyali ökaryotik olmalıdır.

İnsan yapay kromozomu (HAC)

HAC’lar, insan DNA dizileri, sentromer dizisi, telomer dizisi ve DNA replikasyon noktasının olması ile gen tedavisi için avantajları olan bir vektördür. Daha büyük insan DNA’sini taşıması; stabiliteyi sağlayacak sentromer dizisinin olmasi; kromozom yapısının stabilitesini ve degradasyonunu önleyen telomer dizilerinin olmasi; DNA replikasyon noktası ile bir hücre siklusundan diğerine normal S fazında replikasyonu düzenleyebilmesi avantajlarıdır. 6-10 megabaz uzunluğundadır. Transferi, liposomlar veya reseptörler aracılığı ile veya in vivo olarak da oluşturulabilir.

DNA vektöre nasıl sokulur?

Burada önemli bir olayda DNA nın vektör içerisine sokulabilmesidir. Bunun için DNA nın kesilmesi gerekir. Restriksiyon enzimlerin bulunması bu sorunu çözmüştür. Bu enzimler DNA da özel baz dizilerine bağlanır ve DNA nın her iki ipliğini de keserler. Bu enzimler birçok farklı bakteri tarafından doğal olarak yapılmaktadır. Bu enzimlerin amacı bakteriyi yabancı DNA saldırılarından korumaktır. Bakterilerde yapılan çalışmalar sonunda yüzlerce restriksiyon enzim bulunmuştur ve bugün bunlar ticari olarak satılmaktadır. DNA manüplasyonunda kullanılan enzimler

1-DNA Polimerazlar:

Nükleotidlerin polimerizasyonunu katalizleyen enzimdir.Bu enzim DNA nın tek ipliğini kullanarak deoksiribonukleotidleri 3’ ucuna kademeli olarak ilave eder ve ipliğin uzamasını sağlar. Burada DNA polimeraz DNA ipliğini kalıp olarak almıştır. RNA ipliğini kalıp olarak kullanan DNA polimeraz ise Ters transkriptaz olarak tanımlanır. Bu bir RNA ipliğinden bir DNA ipliğinin yapımını sağlar.3 tip DNA polimeraz bulunur.

1-Pol.I, DNA daki zararların onarımında, RNA primerin uzaklaştırılmasında ve meydana gelen boşlukların doldurulmasında iş görür.

2-Pol II, bununda DNA nın onarımında görev yaptığı kabul edilmektedir

3- Pol III, replikasyondan sorumlu esas enzimdir.

DNA polimerazlar bir ipliğin sentezini başlatamazlar. Bunların sentez yapabilmeleri için serbest bir 3’ uca gereksinim duyarlar. Bu durumda serbest 3’ uc RNA polimeraz enzimi ile yapılan yaklaşık 10 nukleotidlik bir dizi ile sağlanır bu diziye primer denir.

2-RNA polimeraz:

Bu enzim bir DNA ipliğini kalıp olarak kullanıp bir RNA ipliği meydana getirir. RNA polimeraz temelde DNA polimerazla aynı temel özelliklere sahiptir.

3-DNA ligaz:

Bu enzimler 5’-PO₄ ve 3’-OH grupları arasında fosfodiester bağı oluşturur. Nukleotidleri birbirine bağlarlar.

4-Nükleazlar

Bunlar fosfodiester bağlarını yok eden fosfodiesteraz cinsi enzimlerdir. İşlevleri bakımından iki gruba ayrılırlar.

1- Eksonükleazlar { Hidroliz reaksiyonu için serbest bir uca gereksinim duyarlar}.

2- Endonukleazlar { Böyle bir gereksinim duymazlar}

Eksonükleazlar etkilerini göstermek için bir zincir ucuna gerek duyarlar. Tek yada çift zincirli halkasal DNA larda etkili değildirler.

Bunlar kesme yönlerine göre 2 tip mevcuttur.

5’→3’ olanlar

3’→5’ olanlar

Endonukleazlar

Çift zincirli DNA da özel dizileri tanıyan ve her iki ipliğinde kesme yapan enzimlerdir. Bu enzimlerin görevi: yabancı DNA ları kesip atmaktır Restriksiyon enzimleri 3 grup altında toplanır

Tip II Restriksiyon endonukleazlar İki tip kesme şekli gösterir

Kör uc oluşturarak kesme
Yapışkan uc oluşturarak kesme

Ribonukleazlar

Bu enzimler RNA ların işlenmesinde önemli görevler yaparlar.

1- Primer transkiptin olgun RNAya geçmesinde RNA ya ilaveler yapmak veya çıkarmak

2- İntronların kesilip çıkarılmasını sağlamak

3- Fosfataz bağlarının hidrolizini sağlamak.

Bunlar da 2 tipe ayrılırlar

Endoribonukleazlar ( Zincir içindeki bağları keserler)

5’→3’ ve 3’→5’ yöne kesme yapanları mevcuttur Ekzoribonükleazlar RNA nın ucundan nukleotidleri ayırırlar Artık bir genin klonlanması için elimizde her türlü aletimiz mevcuttur. Farz edelim ki elimizde ampR ve lac Z genini taşıyan bir plasmid vektörümüz ve kromozomal DNA mız var. Her ikisi de aynı restriksiyon enzimi ile kesilir, böylelikle plasmid de ve kromozomal DNA da meydana gelen kesik uçlar aynı yapışkan uçları içerecektir. Kromozomal DNA kesilmesi sonucu çok sayıda fragment meydana gelir. Biz içinde β-globin genini içeren DNA parçasını plasmide sokmak istiyoruz, bunu plasmide girip girmediğini bu genin çalışmasıyla anlayabiliriz. Bu çalışma esnasında bu geni içermeyen birçok fragment plasmide girecektir ancak seçici besi yeri ile bu genin girip girmediği anlaşılabilir.

Burada farklı bağlanmalar oluşabilir.

Vektör tekrar kendine bağlanabilir
Vektöre kromozomal DNA bağlanabilir. Bu β-globin geni içerebilir veya içermez Vektörün E. coli (konak) hücresine transferi için, bakteri hücresi ile uyumlu olmalıdır. Eğer uyumlu ise buna kompotent hücre denir. Vektör bakteriye transfer olabilir. Şayet değilse bazı deterjantlarla hücre kompotent hale getirilmelidir. Bu olaya transformasyon denir. Bakterinin plasmidi alıp almadığı işret genleri ile anlaşılabilir. Burada plasmid konağa girmişse bu bakteri amp içeren besi yerinde yaşayabilir. Çünkü plasmidle birlikte amp direnç geni de bakteriye aktarılmış olmaktadır. Plazmidi alan hücrelerde iki tiptir
Kromozomal DNA yı içerenler
Kromozomal DNA yı içermeyenler.

Bunun içinde plasmidin yapısında bulunan Lac Z geni sayesinde anlayabiliriz. Kromozomal DNA bu genin içerisine sokulmaktadır. Bu gen β-galaktozid enzimini kodlamaktadır. Kromozomal DNA bu gen içerisine sokulduğunda artık bu enzim üretilemez. ve bu durumda olan bakteri hücreleri beyaz koloni oluştururlar. Kromozomal DNA içermeyenlerde genin yapısı bozulmadığı için koloniler mavi renkli olurlar. Beyaz koloniler insan kromozomal DNA sını içeren kolonilerdir. Bundan sonraki aşama ise β-globin genini içeren koloninin bulunmasıdır.