FLOW CELL CYTOMETRY COMPENSATION
- Unlabelled boncuk (BD-comp beads beyaz kapaklı tüp) PMT voltaj ayarlarını yapmak için
- İmmunglobulin kappa içeren boncuk (BD-comp beads mavi kapaklı tüp-antikor bağlanma bölgesi içerir)
Deneyde kullanılacak olan antikorlar ile ayrı ayrı muamale edilir
BOYALARIN HAZIRLANMASI
1.tüp: sadece unlabelled boncuk (beyaz kapaklı tüp) (bir damla)
2.tüp: unlabelled boncuk (bir damla) – IgK (bir damla) – kullanılacak antikor (deney miktarı ile aynı)
3.tüp: unlabelled boncuk (bir damla) – IgK (bir damla) – kullanılacak diğer antikor (deney miktarı)
Kullanılmayan parametreleri sil
Experiment
Compensation set-up
Create compensation control
Browser bölümünde çalışma dosyaları çıkmalı
Kaç parametre seçilirse bir fazla tüp çalışma tüpü oluşur
Grid oluşturulmalı (tabloların tamamı shift ile seçilmeli)
LOAD
FSC/SSC (PMT voltaj değerlerini) düzenle
Voltaj değerleri ile oynamak için ‘paramer’ kutusu açık olmalı
RECORD
Record tamamlanınca unload denir
BOYALARIN HAZIRLANMASI
Comp beads: iki tüp; biri negatif kontrol diğeri ise Ig K (antikor bağlanma bölgesi içerir)
1.tüp: sadece unlabelled boncuk (beyaz kapaklı tüp) (bir damla)
2.tüp: unlabelled boncuk (bir damla) – IgK (bir damla) – kullanılacak antikor (miktar ?)
3.tüp: unlabelled boncuk (bir damla) – IgK (bir damla) – kullanılacak diğer antikor (miktar ?)
Anti-mouse immunglobulin kappa: antikor bağlanma bölgesi vardır ve herhangi bir antikor ile bağlanabilir.
Antikor işlemlerinde ışıklı ortamdan kaçınılmalıdır ve antikor eklendikten sonra işlemler hızlıca yapılmalıdır.
Antikor ilavesinden sonra ve sıvı eklendikten sonra, inkübasyon işlemlerinden sonra vortex yapılmalı (bu işlem önemlidir)
Hazırlanan tüpleri vortex yap (medium-5 seconds)
İnkübasyon (karanlık, oda sıcaklığı, 20 dakika)
İnkübasyondan sonra vortex yap
1 ml cell wash ekle
Santrifüj (1200 rpm, 5 dakika, RT )
Santrifüj sonunda pelet gözükmeyecek, süpernatanı uzaklaştırırken pastör pipet kullan tamamen tüpün dibine kadar girme, her tüp için yeni pipet kullan kontaminasyona dikkat et
Vortex
500 Cell wash ekle (okutmak için eklenir, miktar değişebilir)