PYROMARK

Çalışılan parametreler;

KRAS:  12-13, 61 primer miksi kullanılır.

BRAF: V464- 469, V600 iki primer miksi kullanılır.

 

Deney basamakları:

1. DNA hazırlanışı
   1. DNA miktar belirleme
2. PCR hazırlanışı
3. Pyro station work , pyro sekans cihazı programı , holderların hazırlanması
4. Bilgisayarda çalışma kağıdı hazırlama
5. Hibridizasyon-Streptavidin
6. Cihaza yükleme
7. Analiz

 

PCR hazırlanışı

Her çalışmada ayrı tüplerde aşağıdakiler  hazırlanır.

• Hasta örneği
• Wild type control
• Non template control ( örnek yerine su koyuyoruz)

Her çalışmada kodon 12-13 ve kodon 61 için ayrı ayrı hazırlık yapılmalıdır. Dolayısıyla her örnek için 2 PCR tüpü hazırlanmalıdır. 3 örneğimiz olduğu için  ( Hasta örneği, Wild type control, No template control ) 6 PCR tüpü alınır.

 

Hasta 12-13     Control 12-13    NTC 12-13

 

Hasta 61         Control 61        NTC 61

Öncelikle ayrı bir tüpe mixture hazırlanacak. İçine;

Pyromark PCR master mix  (12.5 µl x3 tüp için)

İlgili PCR primeri (Kodon 12-13, ve Kodon 61 için ayrı ayrı) (1µl x3 tüp için). BU AŞAMADA DİKKAT: PCR primerleri ile sekans primerleri farklı olduğu için karışmamalı.     H₂O (6.5µl x3 tüp için)

 

Sonra PCR tüplerine 20 µl dağıtılır.

• İçlerine hasta örneği olan tüplere 5µl DNA (15-30 ng/ul)
• Wild type control örneği olan tüplere 5µl Wild type control konulur.
• No template control örneği olan tüplere de 5µl su koyulur. Kitin içinden çıkan su kullanılır. 18.2 ohm olmalı.

DNA dilüsyonu yaparken de yarıya düşerek yaparsak DNA örneğimiz daha az bozulur.

Wild type control konsantrasyonu da 2ng/µl olmalıdır.

Mutlaka kitten çıkan distile su kullanılmalıdır.

 

THERMAL  CYCLER:   Bütün çalışmaların PCR protokolü aynıdır.

95°C for 15 min Number of Cycles : 1 95°C for 20 sec 53°C for 30 sec 72°C for 20 sec Number of Cycles : 42 72°C for 5 min Number of Cycles : 1 4°C for 5 min Number of Cycles : 1

 

KRAS çalışması için kit iki kutudan oluşur;

Kodon 12-13 ve kodon 61 PCR primerleri ve seq primerleri vardır. PCR ve seq primerleri farklıdır.

İlk önce PCR primerleri kullanılır.

Turuncu kapaklı thermal PCR mix vardır.

Wild type kontrol her çalışma için kullanılmalıdır.

+4 kutusunda; PCR sonrası işlemler için kullanılır.

PCR hazırlamak için kullanılması gereken tüpler;

 

Kartuş temizliği önemli; pudrasız eldiven kullanılmalı, filtresiz uç kullanılmalı.

Pyro station work , pyro sekans cihazı programı, holderların hazırlanması

A.kartuş hazırlığı :

kartuşun üzerine tamamen su konulur. Kullanılan su deionize olmalı. Kartuş kontrolu deneye başlamadan önce yapılmalıdır.

Yazı bize bakacak şekilde; en arka 3 lü kuyucuklara, sağ orta, alt orta ve sol orta kısmına baskı uygula ve suyun alttan çıktığını görülür . Su geliyorsa sorun yok her şey yolunda. Su gelmezse bu işlemi tekrarlamalısın.

HER ÇALIŞMA SONRASINDA KARTUŞ 4  KEZ  ULTRA PURE SU İLE YIKANMALIDIR.

+4 derece sekans solüsyonları ile sekans hazırlığı:

Çalışmaya başlamadan önce vacum station hazırlanmalıdır. H₂O -2  haznesine biraz su konulur. Güç kaynağı ve vacum bölümündeki düğmeler açılır.

H₂O -2  haznesinde bulunan suyun tamamı çekilir. Her filtrenin aynı anda çektiğinden emin olmak için kostar pleytlerine su konulur ve her bir filtrenin çekişi kontrol edilir. Her bir filtre aynı anda çekilmelidir. Eğer bir sorun olursa çalışmayan filtre yenisi ile değiştirilir.

Ethanol (70%) ucucu olduğu için kullanılacağı zaman vakum hazneleri konulmalı. Diğer haznelere uygun solüsyon içeren plastik banyolar oturtulur.

 

PCR  ÜRÜNLERİNE STREPTAVİDİN BOYASI BAĞLANMASI

STREPTAVİDİN:  2 ul

BINDING BUFFER: 40 ul

DEIONIZE WATER (18.2 ohm) : 28 ul

ÖRNEK BAŞINA KULLANILAN MİKTAR. KAÇ ÖRNEK ÇALIŞILACAKSA +1  eklenir.

 

Streptavidin opak bir maddedir köpürmemesi için çalkalanmamalıdır. Streptavidin yatay eksende çevirerek , yavaşça karıştırılır.

Daha sonra 6 tüplük PCR ürünü için tek bir ependorf tüpüne binding solüsyonu ile karıştırılarak hazırlanır:

Streptavidin 2ul x 6 = 12 ul ( 6 tüp için)

Binding buffer 40ul x6 =240ul ( 6 tüp için)

Deiyonize  ultra pür su 18,2 ohm 28 ul x6 =168ul (6 tüp için)

 

Kit içinden çıkan şeffaf plate ‘e uygun kuyucuklara 70 er ul pipetlenir. Bu aşamada 0.3 fazla örnek düşünülerek çalışılmalıdır

PCR ürünleri pyro bilgisayar ( bkz pyro bilgisayar programı hazırlama ) programında oluşturduğun tabloya göre streptavidin karışımı üzerine 10  ul pipetlenir.

 

Plate  in üzeri seal ile iyice kapatılır. Holder alınır ve 1400 rpm de 10 dk oda ısısında çalkalanır. 10 dakikadan az olmamalıdır.

 

SEKANS MİX HAZIRLANMASI

Kodon 12.13 ve kodon 61 için iki ayrı ependorf tüpüne  mix hazırlanır.

Pyromark annealing  buffer 24,2 ul x3 ( 3 tüp 12.13 veya 61 için ayrı ayrı )

Sekans primeri 0,8 x3 ul       (12.13 veya 61 için ayrı ayrı)

Ayrı bir plate e hazırlanan sekans mix 25 er ul uygun kuyucuklara pipetlenir.

 

iki bölge çalışılacaksa iki epfendorf tüpü çıkar. Ayrı ayrı miks hazırla.

Her tüpün ismini dikkatlice oku. Hata yapma. Tüplerin üzerlerine isimlerini yaz.

Pipetaj yapabilirsin. Vorteks yapılabilir. Daha sonra quick spin yap.

Q24 plate lere 25 ul dağıtılmalı.

Q24 plate başlangıç yönüne dikkat edilmeli. Kesik kenarlı kısımdan başlanmalı. Yönler karıştırılmamalı.

Bilgisayarda hazırlanan çalışma listesi nasıl hasırlanmışsa o şekilde primer miksleri dağıtılmalı.

Q24 plate primer miksleri eklendikten sonra workstationda kendi yerine konulmalıdır.

 

WORK STATION DA VAKUM ÇALIŞMASI

Streptavidinli PCR ürünleri shaker dan alınır work stationda ön sol tarafa , sekans master mix li plate ise ön sağ tarafa yerleştirilir.

Vakum cihazı açılır ve birkaç dakika bekletilir.

PCR ürünleri  üzerindeki seal açılır,  vakum ile sıvılar çekilir.

Daha sonra sırası ile PCR ürünleri çekilen vakum tarağı :

Sırası ile 5 sn etanol , 5 sn denaturasyon sıvısı , 10sn pyromark buffer solüsyonlarından geçirilir.

Zamanlama hortumdan sıvı geçişi olduktan sonra 5 e veya ona kadar sayılarak yapılır.

Daha sonra vakum tarağı ters çevrilir ,önce vakum cihazı sonra tarak kapatılır.

Tarak sağ tarafta bulunan sekans plate e daldırılır ve hafifçe sallanır.

 

Workstation işlemi bittikten hemen sonra temizlik yapılmalıdır.

H20-1 su kısmından hafif karıştırarak sıvı çektir.

H20-2 su ksımının tamamı çektirilir.

Plate 80 dereceye gelen ısıtıcıda ( holderda) 4 dk bekletilir.

Diğer holder 4 dereceye buzdolabına koyulur,

 

80 derecede 4 dk bekletilen  plate buzdolabında ki holdere koyulur 4 derecede 15 dk bekletilir.

Plate 15 dk sonunda pyro cihazına yerleştirilir, okutulur.

Bu aşamada cihaz kartuşu hazırlanabilir.

Kartuş  yüklerken filtresiz pipet ucu kullanmalısın.

Bilgisayardan alınan çıktıya göre hazırlama yapılır.

E-mix ve S-mix -20C de saklanır. Karanlıkta saklanmalı. Alimünyum folyo ile kapalı olmalı.

Kartuşa enzim ve substratı ekle

Nükleotidleri olması gereken yerlere ekle.miktarları kontrol et. Nükleotidler farklı miktarlar olabilir

CİHAZDA PROGRAM HAZIRLAMA

Cihaz ile bilgisayar arasında doğrudan bir bağlantı yok. Bilgisayarda program hazırlandıktan sonra USB ile cihaza yüklenir.

PyromarkQ24 programı açılır.

METHOD AYARLARI KARTUŞ ÜZERİNDEKİ  DEĞERLER İLE AYNI OLMALIDIR.

HASTA ADI YA DA AÇIKLAMA YAZILABİLİR.

Bu tablo PCR ürünlerinin plateki yerleri ile aynı olmalıdır.

BU DOSYAYI USB İLE PYRO SEQ CİHAZINA AKTAR.

USB DE BULUNAN DOSYA CİHAZDA AÇILIP  HERŞEY HAZIRLANDIKTAN SONRA ÇALIŞTIRILIR.

MASTER MIX SOLUSYONUNU VORTEX YAPMA.

MIX DAĞITIRKEN HOMOJEN DAĞITMAYA DİKKAT ETMELİSİN.

Alınan çıktıdaki solusyonlar ve değerler kartuşa dikkatli bir şekilde yüklenir.

Önce enzyme mix koyabilirsin.

Solusyonlar kartuşa yüklenip hemen cihaza konulur.

NUKLEOTİDLER +4 C DE KALMALI KESİNLİKLE -20C DE OLMAMALI

Pyromark analiz :

Pyromark Q24 programı çalıştırılır.

Analiz cihazındaki flaştaki bilgi yüklenir.

Analiz açılır.

Mavi renk çalışma düzgün,sonuç verilebilir,

Kırmızı çalışmamış,sonuç verilemez,

Sarı bir hata olduğunu gösterir, DNA yoğunluğu az olabilir.

İnceleme tablaya bakılarak kontrol eldir.

Wild type codondaki değişiklikleri bize gösterir. LOD değerlerine göre değerlendiririz.

Kodon 12-13 için anlizi incelersek:

 

Bizi mavi kutudaki yüzdeler ilgilendiriyor. Bu yüzdeleri tablodaki LOD değeri ile karşılaştırıyoruz. Eğer LOD değerinden düşük ise sorun yok; yüksek ve 4.7 yi geçmemiş ise tekrar çalışılmalı; 4.8 ve yüksek ise mutasyon sonucu verilmelidir.

Öncelikle pik uzunluğu bağlanan nükleotid sayısı ile doğru orantılıdır.

Bu GGT diye okunur.

Cihaz bize hep ikinci nükleotidin değişim değerlerini verir. G(G)T.  Bu codonun değerleri incenir.

Ancak ilk G değerleri de  incelenmelidir.

 

PyromarkQ24 Kit kutularının içindekiler:

Küçük kutu( -20de saklanacak )

–    Pyromark PCR Master Mix

–    Unmethyloted Human Control DNA

–    Coralload Concentrate

–    PCR Primer Mix Kras 12/13

–    Seq Primer Kras 12/13

–    PCR Primer Mix Kras 61

–    Seq Primer Kras 61

–    H2O

Büyük kutu( +4de saklanacak )

• Binding Buffer
• Anneling Solution
• Wash Buffer
• Subtrate Mix ( Açıldıktan sonra -20 )
• Enzyme Mix (Açıldıktan sonra -20 )
• dATP
• dCTP
• dGTP
• dTTP

Streptavidin ( Vorteksleme ) ( +4de saklanacak )