Klonlama Nasıl Yapılır

Yazar: | 24 Mayıs 2015

                                                                     PCR Örnek Protokol

 

 Cins StokKonsantrasyon AlınanMiktar SonKonsantrasyon
 Kalıp DNA’sı  40 ng/ µl  5 µl  250 ng
İleri Primer 10 µM 5 µl 1 µM
Geri Primer 10 µM 5 µl 1 µM
dNTP Karışımı 10 mM 5 µl 1 µM
Reaksiyon Tamponu 10 X 5 µl 1 X
DNA Polimeraz 5 U 1 µl 0,1 U
Deiyonize Su 24 µl
Toplam 50 µl
Program Sıcaklık Süre Döngü Sayısı
İlk Denatürasyon 95 oC 5 dakika 1
DenatürasyonBağlanmaPolimerizasyon 95 oC 30 saniye 30
55 oC 30 saniye
72 oC 1.5 dakika
Son Polimerizasyon 72 oC 5 dakika 1

PCR ürünün modifikasyonu için restriksiyon enzim kesimi

Cins StokKonsantrasyon AlınanMiktar SonKonsantrasyon
 PCR ürünü 70 ng/ µl 45 µl 2250 ng
Enzim A 10 U 1  µl 0,1 U
Enzim B 10 U 1  µl 0,1 U
Reaksiyon Tamponu 10 X 10  µl 1 X
Deiyonize Su 43 µl
Toplam 100  µl

Vektör olarak kullanılacak olan plasmidin restriksiyon enzim kesimi

Cins StokKonsantrasyon AlınanMiktar SonKonsantrasyon
 plazmid DNA 70 ng/ µl 55 µl 3850 ng
Enzim A 10 U 2  µl 0,1 U
Enzim B 10 U 2  µl 0,1 U
Reaksiyon Tamponu 10 X 10  µl 1 X
Deiyonize Su 31 µl
Toplam 100  µl

 Insört ve Vektör Ligasyon Reaksiyonu

Cins StokKonsantrasyon AlınanMiktar SonKonsantrasyon
 Insört / Enzim A-B 70 ng/ µl 1 µl 70 ng
Vektör / Enzim A-B 30 ng/ µl 3 µl  90 ng
T4 DNA Ligaz    5 U/μl 1 µl 0,2 U
T4 DNA Ligaz Tamponu 10 X 1  µl 1 X
Deiyonize Su 4 µl
Toplam 10 µl

 Transformasyonun Koloni PCR ile kontrolü

 Cins Stok Konsantrasyon Alınan Miktar Son Konsantrasyon
 Kalıp DNA (koloni olarak )İleri Primer  10 µM  1 µl  0,4 µM
Geri Primer 10 µM 1 µl 0,4 µM
dNTP Karışımı 10 mM 1 µl 0,4 µM
Reaksiyon Tamponu 10 X 2,5 µl 1 X
Paq DNA Polimeraz 5 U 0,5 µl 2,5 U
Deiyonize Su 19 µl
Toplam 25 µl

 

Bir Cevap Yazın

E-posta hesabınız yayımlanmayacak. Gerekli alanlar * ile işaretlenmişlerdir