Kandan Total RNA İzolasyonu

Yazar: | 24 Mayıs 2015
Kandan Total RNA İzolasyonu

kan mor kapaklı tüplere (hemogram tüpleri) alınmalı

alınan kan aynı gün içinde RNA izolasyonu yapılmalıdır. kan alındıktan sonra +4C de bekletilmelidir.

hemogram sonuçları olmalı

WBC sayısı en fazla 70 milyon olmalıdır.

lökosit sayısı oranlaması yapılmalıdır. bu oran için;

1 ul de 8 000 hücre varsa

x ul de 70 milyon hücre vardır

x= a ml

a ml kan alınıp üzerine 3a ml RBC lysis solution eklenir.

WBC sayısına bağlı olarak kullanılack olan solusyonlar kit protokolünde bulunuyor.

 

* alınan kanın 3 hacmi kadar RBC lysis solüsyonu eklenir. karıştır.

* oda sıcaklığında 10 dakika inkübasyon (arada karıştır)

* santrifüj 2 000xg  2,5 dakika (santrifüj sonrasında altta beyaz hücreler lökositler olmalı)

* RBC lysis solüsyonu ekle (kullanılan kanın 2 katı kadar- bu aşama RBC lerden tam olarak uzaklaşmak için gerekli)

* santrifüj 2 000xg 2,5 dakika at RT

* süpernatanı dök falkonu peçete üstüne ters çevir.

* falkonda kalan süpernatanı tüpün dibine değdirmeden pipetle al.

* kitin içinde lysis solusyonu var.  B-merkaptoethanol eklenmeli (1 ml lysis- 10 ul B-merkaptoethanol: hazırlanan solüsyon 1 ay boyunca oda sıcaklığında saklanabilir )

* lysis(B-merk içermeli) solüsyonunu ne kadar ekleneceği kit protokolünde sayfa 14 de yazıyor.

* lysis eklendikten sonra pipetaj yap. (Bu kısım önemli, vortex yap ve sümüksü fazın akışkan halde olduğunu gör, eğer vortex aşamasından sonra  akışkan bir şekilde pipete gelmezse üzerine lysis tamponu ekle)

* bu aşamada -20C de bekletilebilir (4 hafta)

* önce yeşil kolon kullanılır ve altta kalan sıvı alınır (kolon elek olarak kullanılır atıklar istenmeyenler üstte kalır)

* santrifüj 400 xg de 1,5 dakika at RT

* santrifüj bittikten sonra kolon 180 derece çevir tekrar santrifüj 400 xg de 1,5 dakika at RT

* altta kalan lyzatı byeyaz kolonun içine aktar.

* bu aşamada kolonun filtreli bölümüne isimler yazılmalı kolonun kapağına yazılması anlamlı olmaz

* santrifüj max xg de 1,5 dakika at RT

* santrifüj bittikten sonra kolon 180 derece çevir tekrar santr.

* 400 ul wash 1 ekle

* santrifüj 13 000 xg de 2,5 dakika at RT

* alt kısmı at kolonu temiz tüpe aktar

* 200 ul wash 2 ekle

* santrifüj 13 000 xg de 1,5 dakika at RT

TEKRAR

* 200 ul wash 2 ekle

* santrifüj 13 000 xg de 1,5 dakika at RT

 

ELUTION

* kolonu yeni tüpe aktar

* 50 ul elution buffer ekle

* * 200 ul wash 2 ekle

* santrifüj 13 000 xg de 1,5 dakika at RT

 

ALTTA KALAN KISIM TOTAL RNA -70 -80C ARASINDA SAKLANIR

İzole edilen total RNA – 80C de küçük hacimlerde saklanmalıdır.

 

Bir Cevap Yazın

E-posta hesabınız yayımlanmayacak. Gerekli alanlar * ile işaretlenmişlerdir