Gen Klonlama İnceleme

Yazar: | 24 Mayıs 2015

Moleküler biyologlar, canlı hücredeki moleküllerin, hücre yapısı ve fonksiyonuna nasıl katıldıklarını anlamak isterler. Proteinler hücrenin yapı taşlarını oluştururlar ve bunlar da genlerin  ürünüdürler. Moleküler biyologlar dikkatlerini, proteinlerin yapı ve fonksiyonlarını veya onları kodlayan genlere odakladılar.

Ökaryotik türlerde, bir hücre binlerce farklı protein oluşturur. Bunların hepsinin üstesinden gelmek oldukça zordur. Bu yüzden genleri tek tek ele alarak çalışmak daha kolaydır. Bunun içinde en iyi yöntem o proteini kodlayan genin klonlanmasıdır.

Gen klonlama: Bir genin birçok kopyasını oluşturma ve izolasyonunu ifade eder. Bir genin klonlanması için gerekli laboratuar yöntemleri 1970 lerde bulunmuştur. Bu tekniklerin geliştirilmesiyle bulunan yöntemler hücre biyologları, biyokimyacılar, bitki biyologları, mikrobiyologlar ve biyoteknologlar tarafından kullanılmıştır.

Klonlama çalışmaları 2 DNA molekülünü kapsar.

1- Kromozomal DNA

2- Vektör DNA

Gen klonlanmasında genin kaynağı geni taşıyan türün kromozomal DNA sıdır.  Kromozomal DNA yı hazırlamak için ilk olarak organizmadan hücresel doku elde edilir. Kromozomal DNA nın hazırlanması için hücrenin parçalanması, DNA nın çıkartılması ve saflaştırması için biyokimyasal yöntemler uygulanır.

  1. tip DNA ise vektör DNA olarak bilinen özel DNA parçasıdır. Vektör DNA nın amacı klonlanacak olan DNA parçasının taşınmasında görev yapmaktır. Vektörün en büyük özelliği içinde bulunduğu hücrede (konak hücre) çoğalabilmesidir. Böylece taşıdığı gen de onunla birlikte çoğalacaktır.

 

VEKTÖR DNA

Gen klonlamasında kullanılan aracı moleküllere vektör denir.  Vektörler konakçı organizmada, konakçı organizmadan bağımsız olarak replikasyon (çoğalma) gösterirler. Bakteri DNA’sı harici kendi kendien replike olabilen minikromozomlardır.

BAŞLICA VEKTÖRLER

  • Plazmidler
  • Bakteriyofajlar
  • Kosmidler
  • Bakteri yapay kromozomları (BAC)
  • P1 kökenli yapay kromozomlar (PAC)
  • Maya yapay kromozomları (YAC)
  • Memeli yapay kromozomları (MAC)
  • İnsan yapay kromozomları (HAC)

Doğal olarak bulunan plazmitler büyük ve kullanışsız olduklarından, bunların yerine in vitro ortamda amacına yönlik olarak hazırlanan yapay plazmid vektörler kullanılmaktadır. Üzerlerinde ampisilin, tetrasiklin, kanamisin gibi antibiyotiklere karşı direnç genleri taşırlar. Bunlar seleksiyonda önemli fonksiyonu olan marker genlerdir. Plazmid vektör 10 kb yabancı DNA alabilir.

Bakteriyofajlar

Faj’lar bakteriyi enfekte eden virüslerdir. Fajların bazıları, kendi konakçılarında lizis meydana getirmelerine karşın, bir kısmı da bakteri içinde bulunduğu halde herhangi bir zararlı etkide bulunmazlar.

Bu tür fajlar bakterinin genomu ile birleşir, onun bir devamı haline gelir, onunla birlikte eş zamanlı olarak replike olur ve her hücre bölünmesi sırasında da, bakteri DNA’sı ile birlikte kardeş hücreye aktarılır.

Kosmidler

Kosmid vektörler, bir bakteriye ait ve replikasyon orijin bölgesine sahip plasmidle, buna birleştirilmiş lambda fajı yapışkan ucundan (cos, cohesive ends) oluşturulmuşlardır (hibrit vektörler).

Tek cos bölgeli kosmid vektörler: Bu vektörler için lambda fajının  lineer faj DNA’sındaki cos bölgeleri RE’lerle kesilerek çıkarılır. Bunlar, pBR322 plasmidinin tetrasiklin geni içine integre edilir ve böylece tek bir cos bölgesine sahip kosmid vektör elde edilir.

Böyle bir kosmid yaklaşık 6 kb uzunlukta olup, yapısında plasmide ait replikasyon orijini (RO) ,ampr geni ve lambda fajının cos bölgesi bulunur. Bu tarzda hazırlanan kosmid yaklaşık 35-40 kb uzunlukta yabancı bir geni kabul edebilir ve aktarabilir.

Çift cos bölgeli kosmid vektörler:  İki cos bölgesine ve iki markere (ampr, kanr) sahip vektörlerdir. Kosmidler iki RE ile aynı anda kesildiğinde iki lineer parça elde edilir ve her birinde bir cos bölgesi ve bir marker bulunur. Yabancı gen DNA’sı, iki cos bölgesi arasına integre edilir. diğer işlemler aynen tek cos bölgeli kosmidde olduğu gibi yürütülür.

Mekik (shuttle) kosmid vektörler:

Bu  tarzda dizaynı yapılan vektörlerde cos bölgeleri ve markerleri yanı sıra prokaryotik ve ökaryotik hücrelere ait genetik DNA sekansları da bulunur. Bunlar da 35-40 kb’lık yabancı DNA’yı  kabul edebilir ve transferini sağlayabilir.

 Bakteri yapay kromozomu (BAC)

Farklı türlerden alınan  100,000 ile 200,000 baz büyüklüğünde DNA parçalarının bakteride klonlanması ile olur. Klonlandığı zaman hücre içinde birçok kopyası olur. BAC vektörleri doğal olarak var olan büyük bakteri plazmidi F-faktör üzerine kurulurlar. BAC vektörleri büyük DNA fragmentlerini klonlamada ve özellikle büyük genomların sıra dizilerinin eldesinde kullanılırlar.BAC vektörü 300kb’a kadar yabancı DNA’yı içine alabilir.

Maya yapay kromozomu (YAC)

Çok büyük DNA (200-500 kb veya 1–2  Mb ) fragmentlerini kabul edebilir. Bir kromozomun önemli öğeleri olan telomerleri, sentromeri ve replikasyon başlangıç noktasını içerirler. Oldukça kararlıdır ve insan genomunun haritalanmasında, genomik kütüphanelerin yapılmasında etkili bir şekilde kullanılır.

 Memeli yapay kromozomu (MAC)

Memeli yapay kromozomları, kromozomların fonksiyonel bölgelerini (sentromer,telomer,replikasyon orijini) taşıyan ve hücreden bağımsız olarak çoğalabilen moleküllerdir.MAC yüzlerce kb büyüklüğünde genomik DNA taşıyabilir.

MAC oluşumu en yakın örnek olan YAC’a göre çok daha zordur.Çünkü memeli telomeri maya telomerinden 10-100 kat; memeli sentromeri ise maya sentromerinden yaklaşık 1000 kat daha büyüktür.Memeli sentromer ve telomer dizilerinin çok fazla sayıda tekrarlanması da memeli yapay kromozomu oluşturulmasını zorlaştırır. Bunlar hem E. Coli, hem de ökaryot alıcıda çoğalan shuttle vektörlerdir. Virüsten gelen ökaryotik replikasyon orjini taşırlar (SV40).

Klonlanan genin promoter dizisi ve transkripsiyon terminasyon sinyali ökaryotik olmalıdır.

İnsan yapay kromozomu (HAC)

HAC’lar, insan DNA dizileri, sentromer dizisi, telomer dizisi ve DNA replikasyon noktasının olması ile gen tedavisi için avantajları olan bir vektördür. Daha büyük insan DNA’sini taşıması; stabiliteyi sağlayacak sentromer dizisinin olmasi; kromozom yapısının stabilitesini ve degradasyonunu önleyen telomer dizilerinin olmasi; DNA replikasyon noktası ile bir hücre siklusundan diğerine normal S fazında replikasyonu düzenleyebilmesi avantajlarıdır. 6-10 megabaz uzunluğundadır. Transferi, liposomlar veya reseptörler aracılığı ile veya in vivo olarak da oluşturulabilir.

DNA vektöre nasıl sokulur?

Burada önemli bir olayda DNA nın vektör içerisine sokulabilmesidir. Bunun için DNA nın kesilmesi gerekir. Restriksiyon enzimlerin bulunması bu sorunu çözmüştür. Bu enzimler DNA da özel baz dizilerine bağlanır ve DNA nın her iki ipliğini de keserler. Bu enzimler birçok farklı bakteri tarafından doğal olarak yapılmaktadır. Bu enzimlerin amacı bakteriyi yabancı DNA saldırılarından korumaktır. Bakterilerde yapılan çalışmalar sonunda yüzlerce restriksiyon enzim bulunmuştur ve bugün bunlar ticari olarak satılmaktadır. DNA manüplasyonunda kullanılan enzimler

1-DNA Polimerazlar:

Nükleotidlerin polimerizasyonunu katalizleyen enzimdir.Bu enzim DNA nın tek ipliğini kullanarak deoksiribonukleotidleri 3’ ucuna kademeli olarak ilave eder ve ipliğin uzamasını sağlar. Burada DNA polimeraz DNA ipliğini kalıp olarak almıştır. RNA ipliğini kalıp olarak kullanan DNA polimeraz ise Ters transkriptaz olarak tanımlanır. Bu bir RNA ipliğinden bir DNA ipliğinin yapımını sağlar.3 tip DNA polimeraz bulunur.

 1-Pol.I, DNA daki zararların onarımında, RNA primerin uzaklaştırılmasında ve meydana gelen boşlukların doldurulmasında iş görür.

 2-Pol II, bununda DNA nın onarımında görev yaptığı kabul edilmektedir

 3- Pol III, replikasyondan sorumlu esas enzimdir.

DNA polimerazlar bir ipliğin sentezini başlatamazlar. Bunların sentez yapabilmeleri için serbest bir 3’ uca gereksinim duyarlar. Bu durumda serbest 3’ uc RNA polimeraz enzimi ile yapılan yaklaşık 10 nukleotidlik bir dizi ile sağlanır bu diziye primer denir.

2-RNA polimeraz:

 Bu enzim bir DNA ipliğini kalıp olarak kullanıp bir RNA ipliği meydana getirir. RNA polimeraz temelde DNA polimerazla aynı temel özelliklere sahiptir.

3-DNA ligaz:

Bu enzimler 5’-PO4 ve 3’-OH grupları arasında fosfodiester bağı oluşturur. Nukleotidleri birbirine bağlarlar.

4-Nükleazlar

Bunlar fosfodiester bağlarını yok eden fosfodiesteraz cinsi enzimlerdir. İşlevleri bakımından iki gruba ayrılırlar.

1-  Eksonükleazlar { Hidroliz reaksiyonu  için serbest bir uca gereksinim duyarlar}.

2-  Endonukleazlar { Böyle bir gereksinim duymazlar}

Eksonükleazlar etkilerini göstermek için bir zincir ucuna gerek duyarlar. Tek yada çift zincirli halkasal DNA larda etkili değildirler.

Bunlar kesme yönlerine göre 2 tip mevcuttur.

5’→3’  olanlar

3’→5’  olanlar

Endonukleazlar

Çift zincirli DNA da özel dizileri tanıyan ve her iki ipliğinde kesme yapan enzimlerdir. Bu enzimlerin görevi:   yabancı DNA ları kesip atmaktır  Restriksiyon enzimleri 3 grup altında toplanır

Tip II Restriksiyon endonukleazlar İki tip kesme şekli gösterir

  1. Kör uc oluşturarak kesme
  2. Yapışkan uc oluşturarak kesme

Ribonukleazlar

Bu enzimler RNA ların işlenmesinde önemli görevler yaparlar.

1-  Primer transkiptin olgun RNAya  geçmesinde RNA ya ilaveler yapmak veya çıkarmak

2-  İntronların kesilip çıkarılmasını sağlamak

3-  Fosfataz bağlarının hidrolizini sağlamak.

Bunlar da 2 tipe ayrılırlar

Endoribonukleazlar ( Zincir içindeki bağları keserler)

5’→3’  ve 3’→5’ yöne kesme yapanları mevcuttur Ekzoribonükleazlar RNA nın ucundan nukleotidleri ayırırlar Artık bir genin klonlanması için elimizde her türlü aletimiz mevcuttur. Farz edelim ki elimizde ampR ve lac Z genini taşıyan bir plasmid vektörümüz ve kromozomal DNA mız var. Her ikisi de aynı restriksiyon enzimi ile kesilir, böylelikle plasmid de ve kromozomal DNA da meydana gelen kesik uçlar aynı yapışkan uçları içerecektir. Kromozomal DNA kesilmesi sonucu çok sayıda fragment meydana gelir. Biz içinde  β-globin genini içeren DNA parçasını plasmide sokmak istiyoruz, bunu plasmide girip girmediğini bu genin çalışmasıyla anlayabiliriz. Bu çalışma esnasında bu geni içermeyen birçok fragment plasmide girecektir ancak seçici besi yeri  ile bu genin girip girmediği anlaşılabilir.

Burada farklı bağlanmalar oluşabilir.

  1. Vektör tekrar kendine bağlanabilir
  2. Vektöre kromozomal DNA bağlanabilir. Bu β-globin geni içerebilir veya içermez Vektörün E. coli (konak) hücresine transferi için, bakteri hücresi ile uyumlu olmalıdır. Eğer uyumlu ise buna kompotent hücre denir. Vektör bakteriye transfer olabilir. Şayet değilse bazı deterjantlarla hücre kompotent hale getirilmelidir. Bu olaya transformasyon denir. Bakterinin plasmidi alıp almadığı işret genleri ile anlaşılabilir. Burada plasmid konağa girmişse bu bakteri amp içeren besi yerinde yaşayabilir. Çünkü plasmidle birlikte amp direnç geni de bakteriye aktarılmış olmaktadır. Plazmidi alan hücrelerde iki tiptir
  3. Kromozomal DNA yı içerenler
  4. Kromozomal DNA yı içermeyenler.

Bunun içinde plasmidin yapısında bulunan Lac Z geni  sayesinde anlayabiliriz. Kromozomal DNA bu genin içerisine sokulmaktadır. Bu gen  β-galaktozid enzimini kodlamaktadır. Kromozomal DNA bu gen içerisine sokulduğunda artık bu enzim üretilemez. ve bu durumda  olan bakteri hücreleri beyaz koloni oluştururlar. Kromozomal DNA içermeyenlerde genin yapısı bozulmadığı için koloniler mavi renkli olurlar. Beyaz koloniler insan kromozomal DNA sını içeren kolonilerdir. Bundan sonraki aşama ise β-globin genini içeren koloninin bulunmasıdır.

Bir Cevap Yazın

E-posta hesabınız yayımlanmayacak. Gerekli alanlar * ile işaretlenmişlerdir